"Zwei Krebsarten im Vergleich" von Shahira Malash.

Mittelschule Dr. Buchmann
Sommersemester 2009
Zürich
Maturarbeit im Fach Biologie
Zwei Krebsarten im Vergleich
Eingereicht von :
Shahira Malash
Neugasse 30
8005 Zürich
Betreuer:
Herr R. Grison
Herr R. Schwendener
Zusammenfassung
In dieser Arbeit werden anhand von Leukämie- und Melanomzellen zwei verschiedene
Medikamente getestet. Es handelt sich um das Doxorubicin und das Cytosin-Arabinosid. Das
Cytosin- Arabinosid wird in der Medizin bei Leukämie und das Doxorubicin bei Melanomen
eingesetzt. Es ist daher zu erwarten, dass die Medikamente jeweils auf die zugeordneten
Zellen besser wirken. In einem Labor wurden zwei Zellkulturen gezüchtet, die dann
entsprechend behandelt wurden, wobei man zwei verschiedene Auswertungsmethoden
anwendete. Die Melanomzellen wurde mit Hilfe des Mikroskops ausgewertet und die
Leukämiezellen mit der Durchflusscytometrie. Am Schluss stellte sich jedoch heraus, dass das
Doxorubicin das stärkere Medikament bei beiden Zellarten ist. Dies lässt sich durch die
Wirkungsweise der Medikaments erklären. Das Doxorubicin bindet an die Doppelhelix im
Zellkern und verhindert die beiden Stränge miteinander. So wird der ganze Stoffwechsel der
Zelle blockiert und sie zerfällt. Oft platzt dann der Zellkern auf. Das Cytosin- Arabinosid
hingegen lässt sich während der Replikation als falsche Base in die DNA einbauen und
verhindert so, dass sich die beiden Stränge wieder verbinden. Die Zelle wird so in der G1Phase arretiert und stirbt. Die Ergebnisse stimmen mit der allgemeinen Literatur überein.
Die Resultate kann man nicht so einfach auf die Medizin übertragen, weil der Körper sehr
viel komplexer ist. Zum Beispiel wird das Cytosin- Arabinosid im Blut sehr schnell abgebaut,
dies ist bei der Leukämiebekämpfung nicht schlimm, da sich die kranken Zellen im Blut
befinden. Hingegen kann das Medikament seine Wirkung bei den Melanomzellen gar nicht
erst entfalten, weil es gar nicht zu ihnen gelangt. Die erarbeiteten Resultate sind nicht wirklich
stichhaltig, da man diese Versuche mehrmals hätte wiederholen müssen, um ein
aussagekräftiges Resultat zu erhalten.
In dieser Arbeit werden zudem zwei verschiedene Theorien zur Krebsentstehung abgehandelt.
Das eine ist die Stammzelltheorie und die andere die karzinogene- Theorie.
Die Stammzelltheorie baut auf der Unsterblichkeit der Stammzellen und der Krebszellen auf.
Die Theorie der Karzinogene besagt, dass zum Beispiel krebserregende Stoffe zu
Aneuploidien in der Zelle führen können und daraus dann eine Krebszelle entsteht.
Die folgenden drei verschiedenen Behandlungsmethoden werden ebenfalls kurz erläutert,
Chemotherapie, chirurgischer Eingriff und Strahlentherapie.
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
S. 1
2.
Was ist Krebs?
S. 2
3.
Krebsentstehung
S. 3
3.1
Stammzelltheorie
S. 3
3.2
Theorie der Karzinogene
S. 5
4.
Behandlungsmethoden
S. 6
5.
Versuche
S. 7
5.1
Das Vorhaben
S. 7
5.2
Versuch 1 ( Mit Melanomzellen)
S. 7
5.2.1
Die chemische Zusammensetzung der beiden
S. 7
Medikamente
5.3
Ansetzen der Zellkultur
S. 8
5.3.1
Auswertung: Melanomzellen mit Doxorubicin
S. 14
5.3.2
Auswertung: Melanomzellen mit
Cytosin-Arabinosid
S. 15
5.4
Versuch 2 ( Mit Leukämiezellen)
S. 16
5.4.1
So funktioniert die Durchflusszytometrie
S. 16
5.4.2
Auswertung der Ergebnisse bei Leukämiezellen
S. 17
6.
Schlussfolgerungen
S. 19
7.
Anhang
S. 20
8.
Quellenregister
S. 22
9.
Abbildungsverzeichnis
S. 22
10.
Diagrammverzeichnis
S. 24
11.
Tabellenverzeichnis
S. 24
1. Einleitung:
In dieser Arbeit versuche ich die Wirkung verschiedener Medikamente auf zwei unterschiedliche Krebsarten zu testen und so mehr über die Krankheit „Krebs“ zu erfahren.
Ich habe dieses Thema gewählt, weil mich diese Krankheit fasziniert. Die Krebskrankheit ist
deshalb so faszinierend, weil sie sehr schwer zu heilen ist. Es gibt verschiedene Theorien über
ihre Entstehung und den Grund ihrer „Unsterblichkeit“, die sonst nur die Stammzellen besitzen. Ich bin schon oft mit dieser Krankheit konfrontiert gewesen, da ich einige Menschen
kenne, die Krebs haben. Dies ist eine zusätzliche Motivation, mich mit dieser Krankheit zu
befassen. Die bei uns verbreiteten Krebsarten sind Lungen- , Darm-, Prostata-, Brust-, Hautkrebs. Insbesondere der Hautkrebs, die aggressivste Form des Krebses, hat in den letzten 20
Jahren um das Doppelte zugenommen. Die Schweiz weist die zweitgrösste MelanomErkrankungsrate Europas auf und liegt weltweit an fünfter Stelle. Weil Leute eine gebräunte
Haut als schön empfinden, setzen sie sich zu lange den UV-Strahlen der Sonne aus und gehen
im Winter vermehrt ins Solarium. Unterdessen hat die Wissenschaft herausgefunden, dass
auch Solarien den Hautkrebs fördern.
Bei Kindern ist Leukämie die häufigste Krebsart.
In einem Labor an der Uni Irchel bot sich mir die Möglichkeit, einen Aspekt dieser Krankheit
selbst zu untersuchen. Ich habe in Herrn Schwendener einen Wissenschaftler gefunden, der
mir ein Labor und die nötigen Materialien zur Verfügung gestellt hat, um Versuche mit zwei
verschiedenen Arten von Krebszellen zu machen. Er arbeitet in diesem Labor hauptsächlich
mit Melanomzellen (=Hautkrebszellen). Doch er hat mit mir auch die Leukämiezellen angeschaut und behandelt. Ihm möchte ich für die Mithilfe danken.
1
2. Was ist Krebs?
Krebs ist in der Medizin ein Begriff, mit welchem Krankheiten bezeichnet werden, die bösartige Tumore bilden. Es gibt verschiedene Arten von Krebs. Neben Hirntumoren oder Darmkrebs gibt es auch geschlechtsspezifische Krebse, zum Beispiel Brustkrebs bei der Frau und
Prostatakrebs beim Mann. Sie haben eines gemeinsam: nämlich die entarteten bzw. mutierten
und unsterblichen Zellen.
Dabei handelt es sich um Zellen, welche sich unkontrolliert teilen und so gesundes Gewebe
verdrängen oder zerstören. Innerhalb eines Tumors treten verschiedene Zellen auf, da der
Chromosomensatz der Zellen verschieden sein kann. Dies ist eine Folge der Mutation. Somit
kann jede einzelne Zelle eines Tumors einzigartig sein, was auch die Schwierigkeit bei einer
Behandlung darstellt.
Bei vielen Krebsarten entsteht zuerst der so genannte Primärtumor, der Metastasen bilden
kann. Diese können sich an einer anderen Stelle im Körper an gesunde Zellen andocken oder
sich einnisten. Die meisten Patienten sterben an den Metastasen und deren Folgekrankheiten.
2
3. Krebsentstehung
Es gibt verschiedene Ursachen der Krebsentstehung. Die bekannteste ist wohl die radioaktive
Strahlung. Durch die Strahlung wird die DNA so geschädigt, dass unter anderem Krebs entstehen kann. Wie die Atombombe von Hiroshima (1945) oder das Reaktorunglück von
Tschernobyl (1986) gezeigt haben, sind die Auswirkungen verheerend. Auch die UV- Strahlung beim sommerlichen Sonnenbaden kann Krebs hervorrufen, welcher dann Melanom genannt werden. Andere Ursachen, wie zum Beispiel das Rauchen, können zu Lungenkrebs führen.
Auch genetische Vererbung kann der Grund für eine Krebserkrankung sein. Das Auftreten
von Mutationen in den Genen ist eigentlich normal. Wird bei der Replikation - das ist die
Verdopplung der DNA - ein Fehler beim Ablesen der Basen gemacht, wird dieser durch bestimmte Enzyme repariert. Mutationen können auch unbemerkt bleiben. Sind die Kontrollenzyme jedoch geschädigt, werden die Mutationen an die nächsten Zellen weitergegeben. Wenn
auch die Enzyme, die die Apoptose (den Zelltod) einleiten, geschädigt sind, dann ist die Zelle
nahezu unsterblich.
Nun werden zwei Theorien zur Krebsentstehung vorgestellt:
3.1 Stammzelltheorie
Stammzellen können sich zu anderen Zelltypen ausdifferenzieren. Die embryonalen Stammzellen sind pluripotent, dass heisst, dass sie sich zu allen Zelltypen entwickeln können. Die
adulten Stammzellen, können sich aber nur noch zu festgelegten Gewebetypen ausdifferenzieren. Stammzellen sind nischenabhängig. Die Nischenzellen umgeben die Stammzellen und
steuern sie mit Signalen.
Wenn eine Stammzelle sich zu einem roten Blutkörperchen (Erythrozyt) ausdifferenziert,
muss sie sich teilen. Eine der entstehenden Zellen bleibt eine Stammzelle, die andere wird
weiter zu einer Hämoglobinzelle ausdifferenziert. Die Fähigkeit der Stammzelle, sich ständig
„wiederherzustellen“, verleiht ihr eine Art von Unsterblichkeit. Da Krebszellen eine ähnliche
Unsterblichkeit besitzen, baut die Stammzelltheorie auf dieser Ähnlichkeit auf.
Bis heute sind die Krebsstammzellen jedoch nur eine Hypothese, da man ihre Existenz noch
nicht beweisen kann. Viele Hinweise deuten jedoch darauf hin. Zum Beispiel verspricht eine
3
Rückenmarktransplantation bei einer Leukämie sehr viel grössere Heilungschancen als eine
Chemotherapie, weil die Stammzellen ausgetauscht werden.
Krebsstammzellen teilen sich unkontrolliert, was ein Widerspruch zur Funktionsweise der
Stammzellen ist. Es gibt verschiedene Theorien, wie die Krebszelle die Fähigkeit, sich wieder
herzustellen erlangt. Nachfolgend ein Überblick:
1.
Erweiterte Nische
Diese Theorie besagt, dass eine mutierte Stammzelle durch ihre Nischenlage in Schach
gehalten wird, bis eine Veränderung der Nische oder der Stammzelle dazu führt, dass sich
die Nische ausdehnt. Dann können weitere bösartige Stammzellen, die aus der ersten entstehen, sich dort einnisten. So werden mehr Abkömmlinge erzeugt, die den Tumor mit
neuen Zellen versorgen.
2. Ersatznische
Durch eine Mutation ist es der Krebsstammzelle möglich sich an eine neue Nische anzupassen. Dort kann sie ihre Zahl aufstocken und eventuell auch in gesundes Gewebe eindringen.
3. Nischenunabhängigkeit
Mutationen können der Stammzelle die Nischenunabhängigkeit verleihen. So fällt auch
die Abhängigkeit der Signale weg und die Zelle kann sich ungestört teilen und vermehren.
So kann sie den Tumor ohne irgendwelche Kontrollmechanismen mit neuen Zellen versorgen.
4. Mutation zur Selbsterneuerung
Geschädigte Vorläuferzellen - das sind aus Stammzellen entstandene ausdifferenzierte
Zellen - erlangen durch weitere Mutationen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Dadurch
gewinnen sie ihre Unsterblichkeit zurück. Und so werden sie zu Krebsstammzellen1.
1
Vgl. Clarke/Becker, S.60.
4
3.2 Theorie der Karzinogene
Diese Theorie besagt, dass so genannte Karzinogene (krebsfördernde Substanzen) oder andere
Umwelteinflüsse, die erst nach langer Zeit zu Krebs führen, Aneuploidien (siehe Bild 2) verursachen. Das sind Zellen, bei denen durch Mutation einzelne Chromosomen zusätzlich auftreten oder fehlen. Dann herrscht ein Chaos in den Zellen, was sie zu einer Krebszelle macht2.
Abb. 1 Ein normales Karyogramm einer Frau
Abb.2
Aneuploides Karyogramm einer Person mit Leukämie
(Chaos)
4. Behandlung
Obwohl es heute viele Behandlungsmethoden gibt, ist die Medizin noch nicht imstande, den
Krebs vollständig zu heilen. Es besteht immer die Gefahr, dass die Krankheit erneut ausbricht,
weil der Krebs nie vollständig vernichtet werden kann.
Der chirurgische Eingriff ist eine Methode, die man anwendet, wenn die Tumore eine bestimmte Grösse überschritten haben. Dann operiert der Arzt den Tumor heraus. Doch neben
dem chirurgischen Eingriff wird der Patient immer auch zusätzlich noch mit Medikamenten
behandelt, um einem erneuten Ausbruch der Krankheit vorzubeugen. Die medikamentöse
2
Vgl. Duesberg, S.61.
5
Behandlung nennt man Chemotherapie. Sie hat oft schwere Nebenwirkungen, wie zum Beispiel vorübergehender Verlust des Geschmacksinns, Haarausfall und Diabetes.
Die dritte Behandlungsart ist die Strahlentherapie. Bei dieser Therapie wird der Körper bestrahlt und der Tumor so am Wachsen gehindert. Heutzutage hat die Medizin Bestrahlungsgeräte, die es den Ärzten erlauben, den Ort der Bestrahlung so einzugrenzen, dass gesunde Zellen weitgehend verschont werden.
Oft wird der Erkrankte mit einer Kombination der drei Behandlungsmethoden (Chirurgische
Entfernung, Chemo- und Strahlentherapie) behandelt.
Die Versuche, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, beziehen sich ausschliesslich auf die
medikamentöse Behandlung.
Abb. 3 Ein Bestrahlungsgerät mit der die Strahlentherapie durchgeführt wird.
6
5. Versuche
5.1 Das Vorhaben:
In dieser Arbeit werden die beiden Krebsarten Leukämie und Hautkrebs, so genannte maligne
Melanome, anhand von Zellkulturen verglichen und mit zwei verschiedenen Medikamenten
behandelt. Dabei wird die Wirkung der Medikamente auf die Zellen untersucht. Zudem werden die Zellen auch auf ihre Form untersucht und mögliche Unterschiede festgehalten. Die
beiden Medikamente, die verwendet werden, sind das Cytosin-Arabinosid (Abb. 4) und das
Doxorubicin ( Abb. 5). Da das Doxorubicin eher bei Melanomen, also Hautkrebs, eingesetzt
wird3, ist zu erwarten, dass es eine bessere Wirkung auf diese haben wird als auf die Leukämiezellen. Das Cytosin-Arabinosid hingegen sollte eigentlich mehr Wirkung auf die Leukämiezellen haben. Für die Versuche wird immer das gleiche Medium verwendet. Wer mehr
über das Medium erfahren möchte, findet die genaue Zusammensetzung im
Anhang S. 20/21
5.2 Versuch 1 mit Melanomzellen (B16):
5.2.1 Die chemische Zusammensetzung der beiden Medikamente:
C9H13N3O5
C27H29NO11
Abb. 4 Cytosin-Arabinosid ( AraC)
3
Abb. 5 Doxorubicin (Dox.)
Vgl. Moser, S.248
7
5.3 Ansetzen der Zellkultur:
Als erstes muss man eine Zellkultur ansetzen. Da die Kultur steril gehalten werden muss, gibt
es einige Vorschriften, die man beachten muss. Bevor man in den sterilen Raum eintritt, in
dem man die Zellkultur ansetzt, muss man sich die Hände mit einer speziell desinfizierenden
Seife waschen und sie anschliessend noch einmal mit 80%igem Alkohol einreiben. Selbstverständlich müssen auch der Arbeitstisch und die Arbeitsmaterialien steril gehalten werden.
Abb. 6
Die sterile Arbeitsbank.
Die Zellkultur wird in einer so genannten „six-well-Platte“ angelegt. Das ist eine Platte aus
Plastik mit sechs kleinen schalenartigen Vertiefungen.
Abb. 7
Six-well-Platte von oben
Abb. 8
8
Six-well-Platte von der Seite
Diese werden neben anderen Materialien, wie 6 Deckgläschen, mehreren Pipetten und dem
Medium bereit gelegt. Das Medium wird in einem Wasserbad auf 37°C aufgewärmt. Das ist
für die Zellen vorteilhaft, weil
sie bei Körpertemperatur die
besten Wachstumsbedingungen haben.
Abb. 9 Das Wasserbad
Um sicher zu gehen, gibt man auch noch ein Antibiotikum dazu, zum Beispiel Penicillin, um
die Zellen zusätzlich vor einer bakteriellen Verunreinigung zu schützen.
Die Zellen, die in flüssigem Stickstoff aufzubewahren sind, werden zum Auftauen und zur
ersten Vermehrung in eine Flasche mit Medium gegeben und in den Inkubator4 gestellt.
Abb. 10 Der Inkubator von aussen.
Abb. 11 Der Inkubator von innen.
Die Zellen teilen sich alle 24 Stunden. Man erkennt schon an der Farbe des Mediums, in welchem Zustand die Zellen sind. Die Farbe des Mediums verändert sich von rot zu einem gelbbräunlichen Farbton aufgrund saurer Ausscheidungen der Zellen.
Jetzt schaut man die Zellen in der Flasche unter dem Mikroskop an, um ihren Zustand festzustellen.
4
Der Inkubator gewährleistet eine konstante Temperatur von 37°C und eine gleich bleibende Sauerstoffzufuhr.
9
Der Boden ist nahezu ganz bedeckt von einem Teppich aus Melanomzellen. Die Farbe des
Mediums hat sich auch schon in eine dunkel-gelbe Richtung verändert. (siehe Abb. 12)
1
1.
2.
3.
Melanin
dunkle Zelle
helle Zelle
2
3
Abb. 12 Unbehandelte Melanomzellen (Farben mikroskopbedingt verändert)
Die Melanomzellen halten sich mit ihren “Armen“ am Flaschenboden fest. Sie werden mit
einem Enzym namens Trypsin abgelöst. Das Trypsin muss die ganze Oberfläche bedecken,
dafür gibt man ungefähr 5-8 ml dazu. Anschliessend stellt man die verschlossene Flasche für
etwa 10 Minuten in den Inkubator, damit das Trypsin wirken kann. Währenddessen sterilisiert
man die Pinzetten, die man später braucht, mit einem Bunsenbrenner. Die sterilen Deckgläschen legt man in je eine Vertiefung der „six-well-Platte“. Auf diesen Deckgläschen sollen
die Zellen nachher wachsen.
Nach den 10 Minuten haben sich die Zellen vollständig vom Boden der Flasche abgelöst. Mit
einer Pipette saugt man dann einen Teil auf und gibt sie in ein steriles Plastikröhrchen, das
man in die Zentrifuge stellt, um die Zellen von der Flüssigkeit zu trennen. In die Zentrifuge
muss man immer ein anderes Röhrchen mit etwa gleich viel Flüssigkeit als Gegengewicht auf
die gegenüberliegende Seite stellen (siehe Abb. 13).
10
2
1
1
Abb. 13 Eine Zentrifuge, bei der man
die Röhrchen immer gegenüber als
Gewichtsausgleich einsetzen muss.
(1 und 2)
Abb. 14 Zellsuspension nach Zentrifugation.
1. Zellklumpen (sog. Zellpellet)
Nach etwa 5 Minuten haben sich alle Zellen, erkennbar als schwarzer Klumpen (= sog. Zellpellet), auf dem Boden abgesetzt.
Erst dann kann man das Medium mit dem Trypsin über dem Zellpellet vorsichtig mit der Pipette absaugen. Anschliessend muss man eine Pipette mit neuem Medium füllen und zum
Zellklumpen geben. Doch damit sich der Zellklumpen löst, muss man ihn mit der Pipette
mehrmals einsaugen und wieder ausspritzen (= aufschlämmen). Wenn er sich aufgelöst hat,
muss man mit einer speziellen Pipette 100µl Trypanblau in die Zellsuspension geben. Das
Trypanblau färbt die toten Zellen blau.
Das ist wichtig zum Zählen der Zellen. Dafür gibt man sie auf einen bestimmten Objektträger, der Neubauer-Zählkammer heisst. In die vorhandenen Rillen füllt man 10µl von der Zellsuspension und legt anschliessend das Deckgläschen darauf. (siehe Abb. 15)
2
1
1.
2.
Abb. 15 Die Neubauer-Zählkammer
Rille
Deckglas
11
Wenn man das Ganze dann unter das Mikroskop legt, sieht man, dass viele kleine eingeritzte
Rillen zusammen ein Quadrat bilden.
Dieses Quadrat wiederum ist durch etwas dickere Rillen in neun kleine, gleich grosse Quadrate eingeteilt. Jedes dieser Quadrate hat eine Fläche von 1mm². Die vier Quadrate in den Ecken
beinhalten ihrerseits 16 kleine quadratische Felder.
1
Abb. 16 Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop
1. Die 4 zu zählenden Felder
Zum Zählen der Zellen benutzt man nur die vier Quadrate in den Ecken. Es gibt eine genau
festgelegte Zählrichtung. Man fängt oben links an und zählt alle Zellen eines kleinen Quadrates und geht dann nach rechts weiter.
Abb. 17 1 Feld der Neubauer-Zählkammer
Nur diese Zellen werden gezählt.
Diese Zellen werden nicht gezählt.
Man zählt wie bei dem grünen Pfeil (Abb. 17) angezeigt. Um das Ganze zu erleichtern, benutzt man ein kleines Handzählgerät, auf dem man am Schluss die Anzahl ablesen kann.
12
Durch die Färbung mit Trypanblau erkennt man die toten
Zellen und kann sie von der Zählung ausschliessen.
Die oben erwähnte Zählung ergibt 120 Zellen, das macht
30 Zellen pro Feld.
Abb. 18 Neubauer-Zählkammer im Mikroskop
Zum Ausrechnen der Gesamtzellzahl gibt es eine Formel: Es wird der Durchschnittswert, hier
30, mit 10'000 multipliziert. Es ist zu berücksichtigen, dass die Zellsuspension verdünnt wurde. Man hat sie zweifach verdünnt, also muss man die 30 erst mit 2 multiplizieren:
120 Zellen : 4 Felder = 30 Zellen pro Feld
30 Zellen pro Feld ×2 = 60 Zellen pro Feld
60 Zellen pro Feld × 10'000 ml = 600'000 Zellen pro ml
=> Da es insgesamt 5 ml sind, sind ca. 3'000'000'000 Zellen in der Zellkultur vorhanden.
Nun verdünnt man die Zellsuspension 10-mal, um eine angemessene Anzahl Zellen in die sixwell-Platte zu geben. Man nimmt 0.5 ml der Suspension und gibt 4,5 ml vom Medium dazu.
Von dieser verdünnten Suspension verteilt man in die „six-well-Platte“ jeweils 180 µl und
gibt in jede Vertiefung noch mal 4 ml Medium. Anschliessend verschliesst man die „six-wellPlatte“. Wenn man sie nun unter dem Mikroskop anschaut, sieht man, dass die Zellen herumschwimmen. Sie befinden sich nicht auf der gleichen Ebene und deswegen kann man jeweils
nur eine Zelle scharf einstellen.
Die „six-well-Platte“ wird geschwenkt, damit sich die Zellen besser verteilen. Danach stellt
man die Platte für zwei Tage in den Inkubator.
Nach den zwei Tagen zeigt der Blick durch das Mikroskop einen dichten Teppich von Zellen.
Bei den ersten zwei Schalen, die später als Kontrolle dienen, saugt man das Medium ab und
gibt einen Phosphatpuffer als Waschlösung dazu. Damit wird sichergestellt, dass das Medium
vollständig entfernt ist. Das macht man insgesamt zwei Mal. Um die Zellen zu fixieren, bedeckt man sie mit 3,7%igem Formaldehyd. Dieses polymerisiert und verbindet die Moleküle
auf den Zelloberflächen. Die Zellen sterben dabei ab, doch ihre Struktur bleibt erhalten.
Nach 15 Minuten saugt man das Formaldehyd ab und spült die Schalen wieder zweimal mit
dem Phosphatpuffer aus. Danach wird auf den sterilen Objektträger ein Tropfen DAPI- Farbstoff gegeben und das Deckgläschen, mit den Zellen nach unten, auf den Objektträger gelegt.
13
DAPI ist ein Farbstoff, der die Zellkerne blau anfärbt. Zuletzt bestreicht man den Rand der
Deckgläschen mit Nagellack, um das Präparat länger haltbar zu machen.
Zwei andere Schälchen behandelt man mit dem Medikament Doxorubicin.
Zuerst saugt man das alte Medium ab und gibt dann genau 5 ml frisches dazu, um die Konzentration konstant zu halten. Vom Doxorubicin fügt man 10 µl dazu, dies entspricht genau 2
µg pro ml. Um es gut zu vermischen, wird die Schale nochmals geschwenkt.
5.3.1 Auswertung: Melanomzellen mit Doxorubicin
Nach 24 Stunden im Inkubator ist ei Grossteil der Zellen bereits abgestorben. Das erkennt
man an ihrer Form. Wenn sie tot sind, sind sie rund und haben sich vom Plastikboden abgelöst. Lebende Zellen behalten ihre ursprüngliche Struktur.
1
A
B
C
D
2
Abb.19 Bilder der Melanomzellen (Kntrolle und mit Dox behandelt) mit und ohne DAPI- Farbstoff
1. Lebende Zellen
A. Kontrolle B16 Melanomzellen
C. Mit Dox behandelte Melanomzellen
2. Tote Zellen
B. Kontrolle B16 Melanomzellen mit DAPI
D. Mit Dox behandelte Melanomzellen mit
DAPI
14
Die letzten zwei Schalen behandelt man nun mit dem Medikament Cytosin-Arabinosid. Das
Vorgehen ist genau gleich wie bei dem Versuch mit dem Doxorubicin, mit dem Unterschied,
dass jetzt das Cytosin-Arabinosid anstelle des Doxorubicins verwendet wird. Man nimmt die
gleiche Konzentration und lässt das Medikament ebenfalls genau 24 Stunden einwirken.
5.3.2 Auswertung Melanomzellen mit Cytosin-Arabinosid
Beim Blick durchs Mikroskop erkennt man, dass nach dieser Behandlung auch Zellen abgestorben sind, aber deutlich weniger als mit Doxorubicin.
A
B
C
D
1
2
E
F
Abb. 20 Bilder von Melanomzellen (Kontrolle, mit Doxorubicin behandelte & mit
Cytosin- Arabinosid behandelte) mit und ohne DAPI- Farbstoff
A. Kontrolle B16 Melanom
B. Kontrolle B16 Melanom mit DAPI
C. AraC B16 Melanom
D. AraC B16 Melanom mit DAPI
E.
F.
1.
2.
15
Dox Melanom
Dox Melanom DAPI
lebende Zellen
tote Zellen
5.4 Versuch 2 mit Leukämiezellen:
Das Ansetzen der Zellkultur der Leukämie läuft gleich ab wie bei den Melanomzellen, nur
dass die Trypsinzugabe entfällt. Zudem muss man zwischen jedem Schritt die Zellsuspension
zentrifugieren, da die Zellen in der Suspension schwimmen und sich nicht wie die Melanomzellen festhalten.
Man nimmt auch nicht den DAPI- Farbstoff, weil man die Zellen nicht mit dem Mikroskop
auswertet, sondern mit dem Durchflusszytometer. Dieses Gerät zählt die Zellen und bestrahlt
sie mit Lasern. Dieses Verfahren eignet sich für die frei umher schwimmenden Leukämiezellen.
1
Abb. 21 Das Durchflusszytometer
1. Dort stellt man das Röhrchen mit der Zellsuspension rein.
5.4.1 So funktioniert die Durchflusszytometrie:
Die Fluoreszenz der Zellen verändert sich, je nach Stadium in der sich die Zelle gerade befindet. Es werden die S-, G1- und G2 /M - Phasen5 und die Apoptose (Zelltod) unterschieden.
Die Maschine saugt die Zellsuspension durch ein Röhrchen ein, durch das jeweils nur eine
einzige Zelle passt. So kann sie die Zellen zählen und gleichzeitig bestrahlen. Dann erscheinen am angeschlossenen Computer Diagramme, die das Ergebnis anzeigen.
5
S-Phase: Phase während der Mitose, in der die Replikation stattfindet.
G1-Phase: Zellwachstum und Bildung von Organellen.
G2 /M- Phase: Zellwachstum und Vorbereitung auf die nächste Mitose.
16
5.4.2 Auswertung der Ergebnisse bei Leukämiezellen
Ara-C 50 µM
Diagramm 1.: Ara-C 50 µM
Die senkrechte Achse zeigt die Anzahl Zellen an und die horizontale Achse die Fluoreszenz.
Bei diesen Diagrammen der mit Cytosin-Arabinosid behandelten Leukämiezellen ist zu erkennen, dass sich die meisten Zellen in der G1 –Phase befinden. Es folgt ein schmaler Teil,
der die S-Phase zeigt. Die kleine Erhebung am Schluss zeigt die G2 /M Phase.
Diese Aufteilung lässt sich durch die Wirkungsweise der Medikamente erklären.
Das Cytosin-Arabinosid lässt sich während der Replikation als falsche Base einbauen. Dann
können sich die beiden DNA-Stränge nicht mehr verbinden. Deshalb bleiben die Zellen in der
G1-Phase. Die Folge davon ist, dass es nur wenige Zellen in der S-, und der G2 /M-Phase gibt.
Diese Zellen wurden über 24 Stunden mit beiden Medikamenten behandelt. Bei längerer Behandlung würde es mehr Zellen in der Apoptose geben. 5`000 Zellen wurden insgesamt gezählt.
Dox 1 µM
Diagramm 2.: Dox 1 µM
Einige der mit Doxorubicin behandelten Zellen befinden sich in der Apoptose (der Pik am
Anfang, rot angestrichen). Die meisten sind wiederum in der G1-Phase. Dann folgt eine
17
niedrigere S-Phase und am Schluss folgt noch die etwas breitere, aber eher niedrigere G2 /MPhase. Doch die Zellen werden nicht wie beim Ara-C in der G1-Phase arretiert. Sie können
weiterhin ihren Zellzyklus fortsetzen, bis sie die G2 /M-Phase erreichen.
Die dargestellten Piks lassen sich mit der Funktionsweise des Medikamentes erklären. Das
Doxorubicin bindet an die beiden Stränge der DNA und verhindert so eine weitere Teilung.
Durch diese Bindung werden auch verschiedene Stoffwechselvorgänge in der Zelle blockiert.
Meist platzt der Zellkern und die Zelle stirbt. Sie geht in Apoptose.
Bei Betrachtung der unbehandelten Zellen fällt auf, dass das Diagramm dem vom Ara-C ähnelt: eine grosse G1-Phase, eine schmalere S-Phase und ein kleiner Pik bei der G2 /M-Phase.
U973 unbehandelt
Diagramm 3.: Unbehandelte Leukämiezellen
Die genauere Betrachtung der prozentualen Anteile (siehe Tabelle 1) zeigt, dass der Wert des
Arabinosid-Cytosin sich deutlich von den Unbehandelten unterscheidet. Bei der Behandlung
mit Doxorubicin stellt man fest, dass die Werte der G1-Phase nahezu übereinstimmen. Bei der
S-Phase entspricht die Zahl jedoch nur der Hälfte der unbehandelten Zellen. Dies unterstreicht
die bereits oben erwähnte Wirksamkeit des Medikamentes.
U973
Unbehandelt
Ara-C 50 µM
Dox 1 µM
G1-Phase
52.7 %
84.3 %
52.3 %
S-Phase
33.0 %
5.7 %
15.5 %
G2/M Phase
16.0 %
9.9 %
20.3 %
Apoptose
--
--
14.5 %
Tabelle 1.: Übersicht Werte der verschiedenen Phasen
18
6. Schlussfolgerungen
Beim Vergleich der Ergebnisse beider Versuche stellt sich heraus, dass das Doxorubicin das
stärkere der beiden Medikamente ist. Es hat sowohl bei den Melanomzellen wie auch bei den
Leukämiezellen bessere Ergebnisse erzielt.
Man kann diese Zahlen nicht absolut betrachten. Für eine repräsentative Deutung sind diese
Versuche mindestens 20-30 mal durchzuführen. Dann erhält man einen aussagekräftigen
Durchschnittswert.
Langfristige Versuche zeigen, dass die Medikamente im Labor zwar wirken, diese aber dennoch nicht die abschliessende Lösung zum Heilen dieser Krankheiten sind. Diese Ergebnisse
kann man nicht einfach auf die Medizin übertragen, weil die Medikamente in einem komplexen Organismus, wie dem menschlichen Körper, anders wirken können. Das Ara-C zum Beispiel würde bei den Melanomzellen nicht wirken, weil es im Blut schnell abgebaut wird. Die
Aminosäuregruppe wird im Blut durch die Deaminase abgebaut und das Ara-C wird dann zu
Ara-U. Ara-U hat keine Wirkung mehr auf die Krebszellen. Es würde gar nicht zu den Melanomzellen gelangen, weil es vorher im Blut abgebaut wird. Bei der Leukämie hingegen könnte das Ara-C sofort anfangen zu wirken, weil sich die kranken Zellen bereits im Blut befinden.
Diese Arbeit bietet einen Einblick in die komplexe Welt dieser Krankheit. Auf diesem Gebiet
wird in der Forschung zwar sehr viel gearbeitet, doch derzeit lässt sich noch nicht voraussagen, was die weitere Forschung bringt. Die Forschung ist intensiv auf die Entwicklung eines
Heilmittels ausgerichtet, doch erfordert dies noch intensive Forschungsarbeit. Die Laborversuche im Rahmen dieser Arbeit haben den gewünschten Erfolg gebracht, da die meisten Zellen durch die Behandlung mit den Medikamenten abgestorben sind. Daher sind solche Versuche eine geeignete Basis für weitere Forschungen.
19
7. Anhang:
Das Medium:
Das Medium, das man für den ersten Versuch mit den Melanomzellen braucht, erhält man im
Handel. Man muss es im Labor noch mit Kälberserum anreichen, dann ist es brauchbar. Das
Kälberserum gibt man wegen der vielen Proteine dazu, welche das Wachstum empfindlicher
Zellen fördert. Das Serum wird aus dem Blut von Kälberföten gewonnen.
Das Medium heisst DMEM. DM steht für Dulbecco's Modified und EM für Eagle Medium.
Das Medium wurde von einem Herr Eagle erfunden, und wurde später von einem Herren
Dulbecco verbessert. Es hat einen pH-Wert von 7. Es hat eine hell rote Farbe, welche von
einem Indikator kommt. Die Farbe ändert sich, wenn die Zellen zu lange darin sind. Dann
wird die Farbe hellrot bis gelb. Die Farbänderung kommt von den sauren Ausscheidungen der
Zellen.
Die Zusammensetzung des Mediums:
Angaben in mg/l:
Anorganische Salze:
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CaCl2(wasserfrei.) 200,00;
Fe(NO3).9H2O 0,10;
KCl 400,00;
MgSO4(wasserfrei) 97,67;
NaCl 6400,00;
NaH2PO4.H2O 125,00
Andere Komponenten:
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D-Glucose 4500,00;
Phenolrot 15,00;
Natriumpyruvat 110,00
Aminosäuren:
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L-Arginin HCl 84,00;
L-Cystin 2HCl 63,00;
L-Glutamin 584,00;
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Glycine 30,00;
L-Histidin HCl H2O 42,00;
L-Isoleucin 105,00;
L-Leucin 105,00;
L-Lysin HCl 146,00;
L-Methionin 30,00;
L-Phenylalanin 66,00;
L-Serine 42,00;
L-Threonin 95,00;
L-Tryptophan 16,00;
L-Tyrosine 2Na 2H2O 104,33;
L-Valin 94,00
Vitamine:
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D-Calciumpantothenat 4,00;
Cholinchlorid 4,00;
Folsäure 4,00;
i-Inositol 7,20;
Niacinamid 4,00;
Riboflavin 0,40;
Thiamin HCl 4,00
Herkunft der Zellen:
Die Zellen kann man bei einer Firma per Internet bestellen. Die Melanomzellen (B16) stammen
von einer Maus. Die Leukämiezellen (U 973) wurden von einem Patienten entfernt und weiter
gezüchtet. Der Mann war etwa 34 Jahre alt. Aus der Seite geht nicht hervor, ob der Patient an der
Leukämie gestorben ist. Die Zellen sind schon etwas älter.
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8. Quellenregister
Bücher:
Professor Dr. Kurt Moser (1989) Chemotherapie maligner Erkrankungen, Doxorubicin.
Köln: Deutscher Ärzte-Verlag GmbH. Abkürzung Moser
Dokumente aus dem Internet:
NZZ Online (09.11.2005) „Krebs- eine Stammzell- Krankheit“. URL:
http://www.nzz.ch/2005/11/09/ft/articleDAMJW.html
Zeitschriften:
Clarke, Michael F. und Becker, Michael W. (Januar 07): „Krebs – sind Stammzellen
schuld ?“. In: Spektrum der Wissenschaft, Biomedizin. S. 56 – 63. Abkürzung
Clarke/Becker
Duesberg, Peter (Oktober 07): „Das Chaos in den Chromosomen“. In: Spektrum der
Wissenschaft, Medizin & Biologie. S. 55 – 64. Abkürzung Duesberg
9. Abbildungsverzeichnis:
Abb. 1
Karyogramm einer gesunden Frau aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Mapa_gen%C3%A9tico_o_cari
ograma.jpeg&filetimestamp=20050102021154
Vom 3.12.2008 um 15:39 Uhr ; S. 5
Abb. 2
Aneuploides Karyogramm einer Person mit Leukämie (Chaos) aus
http://www.dkfz.de/de/genetics/images/func_tumorgenetics/karyogramm.jpg
Vom 3.12.2008 um 15:46 Uhr ; S. 5
Abb. 3
Ein Bestrahlungsgerät mit dem die Strahlentherapie durchgeführt wird aus
http://de.wikipedia.org/wiki/Strahlentherapie
Vom 3.12.2008 um 20:10 Uhr ; S. 6
Abb. 4
Ein Cytosin- Arabinosid Molekül aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Cytarabin.svg&filetimestamp=2
0080308225058
Vom 2.11.2008 um 13:13 Uhr ; S. 7
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Abb. 5
Ein Doxorubicin Molekül aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Doxorubicin2.svg&filetimestam
p=20080328201851
Vom 2.11.2008 um 13:07 Uhr ; S. 7
Abb. 6
Die sterile Arbeitsbank von der Autorin ; S. 8
Abb. 7
Die Six-well-Platte von oben von der Autorin ; S. 8
Abb. 8
Die Six-well-Platte von der Seite von der Autorin ; S. 8
Abb. 9
Das Wasserbad von der Autorin ; S. 9
Abb. 10
Der Inkubator von aussen von der Autorin ; S. 9
Abb. 11
Der Inkubator von innen von der Autorin ; S. 9
Abb. 12
Bild von Melanomzellen (Kontrolle, Farben mikroskopbedingt verändert)
von der Autorin ; S. 10
Abb. 13
Eine Zentrifuge aus
http://de.wikipedia.org/wiki/Zentrifuge
Vom 3.12.2008 um 20:20 Uhr ; S. 11
Abb. 14
Zentrifugenröhrchen mit Melanomzellen von der Autorin ; S. 11
Abb. 15
Neubauer-Zählkammer aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Neubauer_improved_counting_
chamber.jpg&filetimestamp=20060215123924
Vom 29.10.2008 um 14:36 Uhr ; S. 11
Abb. 16
Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Neubauer_improved_schema.gi
f&filetimestamp=20060207225650
Vom 29.10.2008 um 14:36 Uhr ; S. 12
Abb. 17
1 Feld der Neubauer-Zählkammer geädert von Autorin aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Neubauer_improved_schema.gi
f&filetimestamp=20060207225650
Vom 29.10.2008 um 14:36 Uhr ; S. 12
Abb. 18
Neubauer-Zählkammer im Mikroskop aus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Bild:Neubauer_improved_with_cells
.jpg&filetimestamp=20060207230755
Vom 29.10.2008 um 14:41 Uhr ; S. 13
Abb. 19
Bilder der Melanomzellen ( Kontrolle & mit Doxorubicin behandelte) mit und
ohne DAPI- Farbstoff von der Autorin ; S. 14
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Abb. 20
Bilder von Melanomzellen (Kontrolle, mit Doxorubicin behandelte & mit
Cytosin- Arabinosid behandelte) mit und ohne DAPI- Farbstoff von der Autorin ; S. 15
Abb. 21
Das Durchflusszytometer von der Autorin ; S. 16
10. Diagrammverzeichnis :
Diagramm 1. :
Ara-C 50 µM ; von Autorin ; S. 17
Diagramm 2. :
Dox 1 µM ; von Autorin ; S. 17
Diagramm 3. :
Unbehandelte U973 ; von Autorin ; S. 18
11. Tabellenverzeichnis :
Tabelle 1.:
Übersicht Werte der verschiedenen Phasen ; von Autorin ; S. 18
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