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LABORWELT
Nr. 3 / 2004 - Vol. 5
Das
Chip-PCR: Modulares
System mit integrierter
Probenvorbereitung
Leistungsfähigkeit des
GVO-Nachweises in
Lebensmitteln
PCR & DNA-Aufreinigung
Single Molecule PCR
und mitochondriale
Rekombination
Marktübersichten:
Thermocyler &
DNA-Aufreinigung
Ultraschnelle DNAAmplifikation mit
Rapid-PCR
Malaria- und SNPDetektion mit RT-PCR
DNA-Konzentration
mit TFF
BIOCOM AG
LW 3_04 Titel2.ok
1
16.06.2004, 12:42 Uhr
-Themenheft
I
Zum Thema
N
왔
T
R
O
INHALT
Patente und der Markt
für PCR und Cycler
왔
BLITZLICHT
쑺 Modulares Chipsystem für schnelle PCR-Analysen
mit integrierter Probenpräparation
4
Dr. Klaus-Stefan Drese et al., IMM GmbH, Mainz
BLITZLICHT
Streit gab es schon immer, wenn es um viel Geld geht. Zum Beispiel
um die Rechte an der Polymerase-Kettenreaktion – eines der wichtigsten Verfahren der biologischen Forschung und molekularen Diagnostik. Branchen-Turbulenzen verursachten unlängst Urteile der Beschwerdekammer des Europäischen Patentamtes (EPA) und des Landgerichtes Düsseldorf.
Konnten sich im März MJ Research und Biozym noch darüber freuen, daß das EPA Applera ein „Thermocycler-Basispatent“ (EP 0 236
069) letztinstanzlich aberkannte, drehte sich der Wind im Juni. Das
Landgericht Düsseldorf stellte fest, daß die real-time-Systeme der
Firmen gegen Appleras Patent für real-time-Thermocycler (EP 0 872
562) verstoßen. Biozym stellte daraufhin den Vertrieb der real-timeGeräte vorerst ein.
Derzeit fechten sieben Unternehmen das besagte Applera-Patent
vor dem EPA an. Direkte Auswirkungen gab es nach dem Urteil auch
auf unsere Marktübersicht Thermocycler (siehe S. 36 ff.): Angesichts
der neuen Faktenlage wurden zahlreiche Informationen zu real-timeThermocyclern geschliffen und vorsorglich geändert.
Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter
www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 53). Wenn
Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen,
Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie
erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.
쑺 Nachweis von gentechnischen Veränderungen in
Lebensmitteln – Möglichkeiten und Grenzen
8
Hermann Broll et. al, Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin
BLITZLICHT
쑺 Ultraschnelle DNA-Amplifikation mit Rapid-PCR
11
Dr. Hanno Hermann et al., Analytik Jena AG
BLITZLICHT
쑺 Highly Flexible Expression Profiling of
Human Genes
15
Peter Mouritzen et al., Exiqon, Denmark
MARKTÜBERSICHT
쑺 DNA-Aufreinigung
18
BLITZLICHT
쑺 Tangentialflußfiltration zur Aufkonzentrierung
und Umpufferung linearer DNA
25
Dr. Margarete Hannappel, Millipore GmbH, Schwalbach;
Florian Sack, Mologen AG, Berlin
BLITZLICHT
쑺 Resistenznachweis in der Malariadiagnostik mit
Real-Time PCR
28
Sevim Duvar et al., GBF, Braunschweig
Unbelassen von den Rechtsstreitigkeiten winken der real-time-Diagnostik neue Kunden durch die Einführung der Kennzeichnungspflicht für gentechnisch veränderte Lebens- und Futtermittel (siehe
Seite 8 ff.) – denn die meisten quantitativen Tests in Europa basieren
auf real-time-PCR.
Ob sich Mikrofluidik-Lösungen im PCR-Markt durchsetzen werden, ist derzeit noch offen. Einen fortgeschrittenen Prototypen eines
neuen modularen PCR-on-the-Chip-Systems mit integrierter Probenvorbereitung stellen wir Ihnen ab Seite 4 vor.
Doch auch weniger aufsehenerregende Innovationen könnten dort
Einzug in die Praxis halten, wo es um Tempo geht. Ein in Jena entwickelter, patentierter neuer Thermocycler mit verbessertem Wärmetransfer schafft locker die doppelte bis dreifache Heiz/Kühlrate konventioneller Cycler und ist kompatibel mit Automationsplattformen. Demnächst wird man wohl auch in High-Impact Journals darüber lesen können. Einen Vorgeschmack, gemeinsam mit zahlreichen
Beiträgen zur PCR und Probenvorbereitung wie etwa der Nukleinsäureaufreinigung (S.18, 35), finden Sie ab Seite 11 ff.
WISSENSCHAFT
쑺 Rekombination humaner mitochondrialer DNA
31
Prof. Dr. Wolfram Kunz et al., Universität Bonn
WISSENSCHAFT
쑺 Transkriptions- und Zellzyklus-Regulation in
normalem und tumorigenem Brustgewebe
32
Prof. Dr. Ralf Hass, Medizinische Hochschule Hannover
BLITZLICHT
쑺 Erhöhte Ausbeute und kurze Aufreinigungszeit bei der Nukleinsäure-Aufreinigung
34
Prof. Dr. Michael Lorenz, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen
PRODUKTE
쑺 Neuer THEQ-Thermocycler
35
MARKTÜBERSICHT
Eine interessante Lektüre wünscht Ihnen
Thomas Gabrielczyk
Elektronenmikroskopische Aufnahme der Bindung von
Streptococcus pyogenes an Kollagenfasern
Foto: Manfred Rohde, Gesellschaft für Biotechnologische
Forschung, Braunschweig
왘 Kennziffer 11 LW 03 · Informationen ordern? · www.biocom.de
쑺 PCR-Thermocycler
36
쑺 Stellenmarkt
44
쑺 Verbände
49
쑺 Produktwelt
50
쑺 Fax-Seite
53
쑺 Termine/Impressum
54
LABORWELT
LW3_04_(03)_tg.ok
5. Jahrgang | Nr. 3/2004
3
16.06.2004, 14:18 Uhr
|3
B L I T Z L I C H T
Miniaturisierung
왔
Modulares Chipsystem für
schnelle PCR-Analysen mit
integrierter Probenpräparation
Dipl.-Ing. Götz Münchow und Dr. Klaus-Stefan Drese,
Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH
und ist durch die erwähnten Heizplatten in
drei Temperaturzonen eingeteilt. Hierdurch
wird ermöglicht, die eigentliche PCR auf weniger als 10 Minuten zu reduzieren, da das
Probenvolumen schon auf dem Weg in die
nächste Temperaturzone entsprechend temperiert wird. Bereits zuvor wurde mit Hilfe der
computerunterstützten Flüssigkeits-Simulation (CFD) festgestellt, daß die Probe bei geeignet ausgeformten Kanälen innerhalb von 0,1
Sekunden die Temperatur der darunterliegenden Heizplatte annimmt. Auch eine weitere
Beschleunigung der Analysezeit auf etwa fünf
Minuten ist daher möglich. Dies geht aber mit
einer Reduzierung der amplifizierten DNA-
Seit der Entdeckung der Polymerase Chain Reaction (PCR) durch den Nobelpreisträger Kary B.
Mullis, 1986, hat sich diese als Analyse- und Diagnostikmethode immer weiter durchgesetzt.
Um den Anforderungen in biochemischen Labors gerecht zu werden, wurden inzwischen PCRGeräte entwickelt, in denen in Mikrotiterplattenmodulen parallel bis zu 384 Proben untersucht
werden können. Das Institut für Mikrotechnik Mainz (IMM) stellt hier ein Prototyp-System vor,
das vorerst nicht die Parallelisierung, sondern vielmehr die Komplettanalyse in den Vordergrund stellt. Ziel ist ein Einwegchip, auf dem alle Prozeßschritte – von der Probenpräparation
über die PCR bis hin zur Detektion – automatisiert durchgeführt werden.
Bei der Entwicklung dieses mikrofluidischen
Systems wird das starre Konstrukt eines einzelnen Lab-on-a-Chip aufgehoben, indem in
der Prototypphase mehrere Polymer-Chips
miteinander kombiniert werden (Abb. 1). Dabei beinhaltet jeder Chip nur Teile der Gesamtfunktion. Diese Aufteilung besitzt mehrere
Vorteile. Zum einen müssen bei einer späte-
Abb. 1: Ferrofluid-Aktuator. Gesamtaufbau des
modularen Mikrofluidiksystems. Dieses beinhaltet bis zu zwölf Module, ferrofluidische Aktoren,
Mikropumpen sowie Ventile und Reservoirs.
ren Verifikation nur die mit der Probe kontaminierten Einzelchips ausgewechselt werden.
Zum anderen kann, je nach Anforderung an
die Analyse, schnell ein geeignetes Chip-System zusammengesetzt und auf Modifikationen von Einzelelementen eingegangen werden. Das Gesamtsystem bleibt in seiner
Grundstruktur erhalten. Dieser modulare
Ansatz bezieht sich dabei nicht nur auf die Probenpräparation oder auf die amplifizierbaren
DNA- oder RNA-Proben, sondern auch auf
den Einsatz anderer Nachweismöglichkeiten,
z.B. mit immunologischen Assays. Des weiteren bietet ein solches System den großen Vorteil, daß bei der Entwicklung neuer Analysesysteme den neuen, kritischen Aufgaben mehr
Aufmerksamkeit gewidmet und weitgehend
auf fertige Lösungen einzelner fluidischer Abläufe zurückgegriffen werden kann.
Ein Kernziel der Entwicklung dieses PCRSystems auf der modularen Plattform ist die
Beschleunigung der PCR auf eine für Pointof-Care-Anwendungen angemessene Zeit.
Konventionelle PCR-Geräte haben häufig den
Nachteil langer Einstellzeiten der für die Reaktion nötigen Temperaturen. Die Ursache
dafür liegt in der thermischen Trägheit der Systeme. In der Regel wird ein einzelner Temperaturblock verwendet, der gemäß dem Protokoll über eine elektronische Steuerung geheizt
und abgekühlt wird. Um diesem Problem entgegenzuwirken, werden bei dem am IMM
entwickelten System die Reaktionstemperaturen in drei voneinander getrennte Temperaturzonen aufgeteilt, und anstatt die Probe an
einem festen Ort zu belassen, wird sie mit Hilfe
einer neuentwickelten Mikropumpe präzise
zu den einzelnen Temperaturbereichen transportiert (Abb. 2). Dabei nutzt die Pumpe die
typischen Eigenschaften einer magnetischen
Suspension (Ferro- bzw. Magnetofluide) aus.
Das Ferrofluid ist auf einem eigens entwickelten Chip in kleinen Kanälen eingeschlossen
und kann mit Hilfe eines Permanentmagneten, der an einem Schrittmotor angebracht ist,
gezielt bewegt werden (Abb. 3).
Der mit dem Ferrofluid befüllte Chip ist
über ein luftgefülltes Kapillarsystem pneumatisch mit einem zweiten Chip verbunden, zum
Beispiel dem für die PCR. Dieser PCR-Chip
enthält dabei das zu analysierende Material
Abb. 2: Transportprinzip des PCR-Systems. Durch
die Bewegung des Magneten erfolgt eine gleichzeitige Bewegung des darüber liegenden Ferrofluids sowie, aufgrund der pneumatischen Verbindung, des Probenvolumens von Heizplatte zu
Heizplatte. Dabei besteht eine hohe Reproduzierbarkeit des Probentransportes. Die Abweichung
der Start- zur Endposition liegt nach über 40 Zyklen unter 100 µm.
Menge gegenüber einem konventionellen
PCR-Cycler einher. Die Verweildauer in den
einzelnen Temperaturzonen kann dabei auf
etwa eine Sekunde reduziert werden und
grenzt somit an die minimale, biochemische
Reaktionszeit eines PCR-Schrittes (Abb. 4). Die
Transportzeit von Heizplatte zu Heizplatte
nimmt im Moment etwa die Hälfte der Gesamtzeit in Anspruch, kann aber durch Modifikation der Ferrofluid-Mikropumpe noch
weiter beschleunigt werden. Das zur Zeit getestete Probenvolumen, bestehend aus einem
konventionellen PCR-Kit (Sigma) und aufgereinigter DNA, beträgt 8 µl und kann anschließend mit einer normalen Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromideinfärbung analysiert werden. In weiteren Versuchen soll das
Probenvolumen reduziert und mit Hilfe des
Insight-Systems, einem Mikroskopsystem zur
molekularen Analyse der Firma Evotec, und
Fluoreszenzsignalen ausgelesen werden.
Durch die Verwendung von transparenten
Polymer-Chips und eines solchen Fluoreszenzmikroskopes ließe sich auch eine RealTime-PCR durchführen.
Eine große Herausforderung ist die Untersuchung von Wechselwirkungen der Reaktionsbestandteile, z.B. der Primer oder Taq-Po-
Kennziffer 12 LW 03 · www.biocom.de
LABORWELT
4 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
LW3_04_(04-6).tg_okokok
4
16.06.2004, 14:20 Uhr
왘
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Biorad-Stand
1
15.06.2004, 11:56 Uhr
B L I T Z L I C H T
lymerase, mit den Mikro-Kanalwänden aus
unterschiedlichen Polymermaterialien. Dabei
stellte sich heraus, daß bei der Verwendung
von PMMA (Polymethylmethacrylat) oder
COC (Cyclo Olefin Copolymer) eine Oberflächenmodifikation notwendig ist. Nur durch
Verwendung biokompatibler Substanzen zur
Beschichtung der Kanalwände wurde ein re-
Abb. 3: Ferrofluid-Aktuator für den Transport und
das Positionieren von Probenvolumina. Der Aktuator ist über ein fluidisches Interface mit dem
PCR-Chip verbunden.
aktionsförderndes Umfeld für die PCR-Reagenzien geschaffen. Andere Materialien, wie
etwa Glas oder Silizium, sind grundsätzlich
für eine PCR geeignet, stellen aus Kostengründen jedoch kaum eine Alternative dar. Schafft
man es statt dessen, einen Chip komplett aus
einem Polymer zu entwickeln, kann dieser mit
Hilfe des Mikrospritzgusses günstig hergestellt und als Einmal-Chip vertrieben werden.
Probenvorbereitung
Die durch die PCR zu analysierende DNAProbe kann ebenfalls auf Chipbasis aus wenigen Mikrolitern Blut gewonnen werden. Dem
Patienten wird Blut abgenommen, zum Beispiel mit Hilfe einer Kapillare aus dem Ohr.
Anschließend wird dieses auf einen im Chip
integrierten Filter aufgetragen und mit unterschiedlichen Puffern gespült. Die Blutzellen,
die das Erbgut nicht enthalten, werden dabei
entfernt. In einem weiteren Schritt werden die
gewonnenen Zellen lysiert und die zur PCR
nötige DNA aus den Zellen extrahiert. Die isolierte DNA-Probe wird aufgefangen, in entsprechendem Verhältnis mit dem PCR-Kit ver-
mengt und anschließend die Amplifikation
innerhalb des PCR-Chips durchgeführt. Der
Chip zur Probenaufbereitung befindet sich zur
Zeit in der Entwicklung, zeigt aber in ersten
Vorversuchen sehr gute Ergebnisse.
Abmessen von Flüssigkeitsvolumina
Das Abmessen von Flüssigkeitsvolumina
wird auch innerhalb eines Chips erfolgen.
Dafür wurde ein Verfahren entwickelt, das
es erlaubt, von einer Flüssigkeitsmenge ein
definiertes Volumen von 0,1 bis 10 µl im Chip
abzumessen. Dieses wird dann über geometrische Strukturen blasenfrei mit einem anderen Probenvolumen vermengt und anschließend gemischt. Beim Mischvorgang
werden die beim Transport entstehenden
Randwirbel in einem Flüssigkeitstropfen ausgenutzt. Diese entstehen durch das parabolische Strömungsprofil, das von einem IMMSimulationsteam für diese Zwecke untersucht wurde. Dieser Mischvorgang kann zusätzlich durch geometrische Veränderungen
des Kanals unterstützt werden, wie etwa
Zickzack-Strukturen.
Die externe Steuerung sämtlicher Flüssigkeitstransporte wird über einen Mikrokontroller in Verbindung mit einem PC (Steuerungssoftware: LabVIEW) kontrolliert. Ergänzt wird das System durch externe Ventile
und konventionelle Mikropumpen, die auf
sogenannten Ventilinseln positioniert werden. Sie verfügen über die gleichen Abmessungen wie die Chip-Module selbst. Damit
ist es möglich, ausgewählte Probenvolumina zu transportieren und den zeitlichen Ablauf zu kontrollieren. Bei der Entwicklung
wird das System manuell über ein Steuerpanel per Mausklick bedient. Ist ein geeigneter
Ablauf identifiziert, werden die einzelnen
Schritte in einem Unterprogramm festgelegt
und das System führt vollautomatisch die
einzelnen Aufgaben durch.
den kann. Dies ermöglicht eine schnelle und
kostengünstige Realisierung von Machbarkeitsstudien sowie die Anfertigung von mikrofluidischen Prototypen. Sobald die Einzelaufgaben gelöst und die Strukturen festgelegt sind, werden diese mit Hilfe eines angepaßten Spritzgußwerkzeugs auf einem einzelnen Chip vereint, welcher in Kleinserie
produziert werden kann. Ziel ist es, den
wachsenden Entwicklungsbedarf der klinischen und industriellen Analytik und Diagnostik an Nachweisverfahren zu decken
und die Entwicklungszeit für ein Lab-on-aChip-System zu beschleunigen.
Das modulare PCR-System wurde in der
IMM-Abteilung Fluidik und Simulation entwickelt und entstand im Rahmen eines Verbundprojektes des BMBF-Förderprogramms
Mikrosystemtechnik 2000+. Die Projektpartner sind das Unternehmen Evotec OAI (Hamburg), das diesen modularen Aufbau an das
oben erwähnte Fluoreszenzmikroskop adaptieren und die PCR-Reaktionen im Chip weiter austesten wird. Zum anderen wird anschließend der dritte Projektpartner als erster
Nutzer, das Endokrinologikum Hamburg
Forschungsgesellschaft mbH in Hamburg,
das Gerät zu Forschungszwecken einsetzen
und im täglichen Gebrauch prüfen.
Anwendung, Service und Zielgruppe
Literatur
Mit diesem „Chip-Based-Lab“ wird ein modulares Konzept umgesetzt, welches es dem
IMM ermöglicht, neue Entwicklungen kostengünstig anzugehen. Die einzelnen Module können auf den zwölf Modulpositionen frei
kombiniert und miteinander verbunden werden. Die Chips werden im Spritzgußverfahren hergestellt und liegen als Rohlinge in den
unterschiedlichsten Materialien vor. Die verwendeten Strukturen werden in einem CAD
(Computer Aided Design)-Programm von
Entwicklungsingenieuren entworfen und – je
nach Strukturgröße – mit Hilfe einer CNCMaschine oder eines Lasers in den PolymerChip übertragen. Abschließend werden die
Chips mit einer etwa 100 µm dicken Polymerfolie gedeckelt. Somit wird aus der Idee schon
nach kürzester Zeit ein testfähiger Chip, der
– einmal in die modulare Plattform eingesetzt
– sogleich angesteuert und verwendet wer-
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
Abb. 4: Temperaturverteilung und Flußgeschwindigkeiten in einem im Mikrokanal eingeschlossenen Flüssigkeitstropfen. Hierbei wird der Tropfen
von der kalten (blau) zur warmen Region (rot)
transportiert und innerhalb von 0,1 Sekunden
aufgeheizt.
C.W. Hirt and B.D. Nichols, J. Comput. Phys. 39, 201, 1981.
M. Kopp, A. de Mello and A. Manz, Science 280, 1046, 1998.
B.C. Giordano, J. Ferrance, S. Swedberg et al., Anal. Biochem. 291, 124, 2001.
I. Schneegaß, J.M. Köhler, Reviews in Molecular Biotechnology 82, 101, 2001.
J. Yang, Y. Liu, C.B. Rauch et al., Lab Chip 2, 179, 2002.
M. Curcio and J. Roeraade, Anal. Chem., 75, 1, 2003.
P.A. Auroux, P.J.R. Day, F. Niggli et al., Proceedings of Nanotech 2003, 55, 2003.
S. Hardt, D. Dadic, F. Doffing, K. S. Drese, F. Jiang, G. Münchow, O.
Sörensen, eingereicht : Proc. of Nanotech 2004, Boston, March 7-11, 2004
Korrespondenzadresse
Dr. Klaus-Stefan Drese
IMM - Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH
Abteilung Fluidik und Simulation
Carl-Zeiss-Straße 18-20, D-55129 Mainz
Tel.: +49 (0)6131-990-170, Fax: -990-205
eMail: drese@imm-mainz.de
www.imm-mainz.de
LABORWELT
6 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
LW3_04_(04-6).tg_okokok
6
16.06.2004, 14:20 Uhr
왘
TILLING: Automated
Reverse Genetics
®
Rapid acquisition of genomic
sequence data has elevated a new
discipline, functional genomics, which
focuses on determination of gene
function. Reverse genetics methodologies are an important
part of functional genomics.
Traditional reverse genetic methods,
such as the use of transposons to
“knock out” a specific gene, can
accurately determine phenotype but
require time consuming transgenic or
sophisticated tissue culture methodologies1. Such “knockout” methods
are limiting because the entire gene
is knocked out – the effects of partial
loss of function of an active gene
cannot be observed.
DETERMINING GENE
FUNCTION THROUGH TILLING
To overcome the limitations of knocking out an entire gene and to expand
knowledge of active gene mutations,
researchers from Fred Hutchinson
Cancer Research Center developed a
process for Targeting Induced Local
Lesions In Genomes, or TILLING2.
Elegantly simple, yet highly efficient,
TILLING uses chemical mutagenesis
to yield a traditional allelic series of
point mutations for virtually all
genes. The TILLING process is of
particular value for essential genes
where sublethal alleles are required
for phenotypic analysis.
GENERATING HIGH
QUALITY TILLING IMAGES
The new LI-COR 4300 DNA Analysis
System is uniquely suited for
TILLING because it uses two-color
infrared fluorescence detection to
generate two true gel images during
electrophoresis. Unprocessed image
data are critical for TILLING because
systems that highly process fluorescence data during detection will likely
filter out most, if not all, mutations.
With the 4300 System as the
enabling technology, the following
TILLING performance results can be
achieved with a single instrument*:
• Up to 750,000 base pairs
screened per run.
• Up to 2000 samples screened
per day.
• Up to 2 million base pairs
screened per day.
• 1000 base pairs per sample.
* Results are dependent on species and other factors.
To Learn more about TILLING and
the LI-COR System, visit our web
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References
1. Colbert, T., Till, B.J., et al 2001. High Throughtput
Screening for Induced Point Mutations. Plant
Physiology 126: 480-484.
2. McCallum, C.M., et al 2000. Target Induced Local
Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional
Genomics. Plant Physiology 123:439–442.
LI-COR (Germany, Austria, Switzerland):
+49 (0) 6172 17 17 771
LI-COR UK Ltd.: +44 (0) 1223 422104
North America: 402-467-0700
LI-COR Model 4300
DNA Analysis System
Licor-Stand
31
www.licor.com
TILLING is a registered trademark of Anawah, Inc.
15.06.2004, 12:03 Uhr
B L I T Z L I C H T
GVO-Diagnostik
왔
Nachweis von gentechnischen
Veränderungen – Möglichkeiten
und Grenzen
Hermann Broll, Dr. Andreas Butschke und Dr. Jutta Zagon,
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin
Lebensmittel, die aus gentechnisch veränderten Organismen (GVO) hergestellt werden, sind
bereits seit 1997 in der Europäischen Union (EU) im Handel. Bis heute nahm seitdem die
Fläche der Anbaufläche mit gentechnisch veränderten Pflanzen weltweit um das 35fache zu –
in Europa ist sie gleichwohl marginal, da bislang außer in Spanien ausschließlich experimentelle Forschungsfreisetzungen die Praxis sind. In erster Linie werden weltweit gentechnisch
veränderte (gv) Soja- (ca. 62%), Mais- (ca. 21%, Baumwoll- (ca. 12%) und Raps-Pflanzen (ca. 5%)
in großem Stil angebaut1. Alle derzeit EU-zugelassenen gentechnisch veränderten Pflanzen
besitzen ausschließlich Gene, die Resistenz gegenüber Pflanzenschutzmitteln oder einen Insektenschutz vor Fraßschädlingen bieten. Damit weisen diese nach Einschätzung der Autoren überwiegend Vorteile für die Bauern auf,
Die Zulassung und Kennzeichnung solcher
Produkte ist bereits seit 1997 gesetzlich geregelt2 – Lebensmittelprodukte mußten danach
immer dann gekennzeichnet werden, wenn
eine gentechnische Veränderung nachweisbar
war. Mit der seit dem 18. April diesen Jahres
geltenden neuen Verordnung (EG) Nr. 1829/
2003 hat sich die Kennzeichnungspflicht verschärft. Nun müssen alle Lebens- und Futtermittelprodukte, die aus GVO gewonnen wurden, gekennzeichnet werden. Zudem wurde
der eingeführte Schwellenwert für eine unvermeidliche und unbeabsichtigte Beimengung von GVO zu gentechnikfrei hergestellten Futter- und Lebensmitteln bezogen auf die
jeweilige Zutat von 1% auf 0,9% gesenkt. Alle
GVO-Anteile darüber müssen gekennzeichnet werden. Auch für Saatgut werden europaweite Regelungen ebenfalls mit sortenspezifischen Schwellenwerten unterhalb von
0,9% GVO-Anteil vorbereitet.
Nachweisverfahren
Zur Überprüfung der Kennzeichnung ist wegen des Schwellenwertes der qualitative Nachweis einer gentechnischen Veränderung nicht
ausreichend. Statt dessen muß der Anteil der
gentechnischen Veränderung bestimmt werden.
Als Methoden für die Überprüfung, ob die
Kennzeichnungsschwelle überschritten wurde, sind mindestens drei unterschiedliche Ansätze denkbar.
– Einerseits kann die zusätzlich eingeführte
DNA-Sequenz direkt mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase
chain reaction) vervielfältigt und anschließend detektiert werden
– oder das neu exprimierte Protein kann
durch immunologische Verfahren wie dem
ELISA identifiziert werden.
– Denkbar ist aber auch der Nachweis eines
möglicherweise veränderten Fettsäuremu-
Tab. 1: Notwendige Kontrollen in der GVO-Analytik
Schritt
Nukleinsäureextraktion
+ (mindestens 1
alle 10 Proben)
+ (in regelmäßigen
Abständen)
Extraktionsblindprobe
Positive Extraktionskontrolle
Positive
DNA-Zielkontrolle
Negative
DNA-Zielkontrolle
AmplifikationsReagenzkontrolle
PCR-Inhibitionskontrolle
Nukleinsäureamplifikation
+
+
+
0 (+, wenn sämtliche PCRPrüfungen der Probe negativ)
+ Verbindlich vorgeschrieben, 0 empfohlen
sters aufgrund der gentechnischen Veränderung mit Hilfe gaschromatographischer
Methoden.
Während die DNA in allen Zellen eines Organismus hinsichtlich der Basenabfolge
identisch ist, kann sich die Proteinexpression von Gewebe zu Gewebe unterscheiden.
Beispielsweise wird in den Körnern der gentechnisch veränderten Maislinie Bt 176 das
neueingeführte cry 1Ab-Gen nur zu 0,1% im
Vergleich zu den anderen Geweben exprimiert, wodurch immunologische Verfahren
nur sehr begrenzt eingesetzt werden können. Eine gentechnische Veränderung in Tomaten der Firmen Calgene (Flavr Savr®) und
Zeneca basiert auf dem Blockieren der Expression des tomateneigenen Polygalakturonase-Gens, dessen Genprodukt für das
Auflösen der Zellwände im Zuge des „Matschigwerdens“ sorgt, durch die „Antisense“Technologie. Dies führt zur Verzögerung der
Reifung. Die Tomate , die daher auch als
„Antimatsch-Tomate“ bezeichnet wird, kann
später als bisher geerntet werden. Da auch
hierbei kein neues Protein synthetisiert wird,
ist der immunologische Nachweis nicht geeignet.
Der DNA-basierte PCR-Nachweis ist demgegenüber fast uneingeschränkt einsetzbar.
Lediglich sehr stark verarbeitete Produkte
wie raffinierte Öle, Soja-Saucen oder ähnliches enthalten nur noch DNA-Mengen unterhalb der Nachweisgrenze. Diese Produkte können daher nicht überprüft werden. Hier
muß gegebenenfalls eine Überprüfung der
Ausgangsstoffe oder eine Überwachung
während des Herstellungsprozesses erfolgen.
Probenahme
Unabhängig von der Nachweistechnologie
steht am Anfang der Analyse die repräsentative Probenahme. Dazu sind unter Umständen mehrere Stichproben zu nehmen,
um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß
die gezogene Probe tatsächlich repräsentativ für das zu untersuchende Material ist.
Beispielsweise besteht nur eine Wahrscheinlichkeit von 50%, daß das Vorhandensein
von 0,1% gentechnisch veränderten Sojabohnen in einer Probe detektiert wird, wenn
dazu 700 Sojabohnen als Analysenprobe verwendet werden und die Methode prinzipiell eine gentechnisch veränderte Sojabohne
in 1.000 Sojabohnen nachweisen kann. Umso
geringer die Stichprobenanzahl ist, die analysiert wird, um so größer wird die Wahrscheinlichkeit einer nicht-repräsentativen
Probe für das zu untersuchende Material.
Weiterhin hat die Verteilung des gentechnisch veränderten Materials einen entscheidenden Einfluß. Handelt es sich um Rohwaren, besteht eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit, daß eine heterogene Verteilung vorliegt,
das heißt, eine „Nesterbildung“ mit erhöhter Konzentration des gentechnisch veränderten Materials zu beobachten ist. Mit zuLABORWELT
8 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
LW3_04_(08-10)_tg.okok
8
16.06.2004, 15:05 Uhr
ik
t
y
l
D i e Al t e r n a t i v e
i n d e r Pr o t e o m a n a
B L I T Z L I C H T
PROTEOMELAB
FROM TISSUES TO TARGETS
Abb. 1: Unterschiedliche Nachweisstrategien
nehmenden Prozessierungsgrad erfolgt auch
eine stärkere Homogeni-sierung des Materials, was letztlich zu einer vereinfachten Probenahme mit weniger Stichproben führt.
Zudem hat die nach der Probenahme zu erfolgende Homogenisierung einen Einfluß auf
das Analyseergebnis. Je feiner die Probe zermahlen wird, also je mehr Partikel pro Gewichtseinheit in der Analysenprobe enthalten sind desto größer wird die Wahrscheinlichkeit eine nur geringe gentechnische Spur
noch zu detektieren. Sind zum Beispiel nur
100 Partikel in der Analysenprobe kann statistisch keine 0,1%ige Verunreinigung mehr
identifiziert werden, da hierfür mindestens
1.000 Partikel notwendig wären.
PCR-Analyse
Im Anschluß an die Probenahme erfolgt bei
der PCR-Analyse die Extraktion der DNA.
Hierbei ist vor allem auf die Eliminierung
etwa vorhandener Inhibitoren zu achten. In
der Literatur sind zahlreiche Stoffe genannt,
die auch in Lebensmitteln enthalten sind und
in erster Linie inhibitorisch auf die Taq-DNAPolymerase wirken7. Zur Identifizierung einer möglichen Inhibition muß nach jeder
Extraktion die isolierte DNA mit einem für
die Zutat spezifischen PCR-System untersucht werden (Tab. 1).
Der PCR-Nachweis der gentechnischen
Veränderung erfolgt zumeist in Stufen (Abb.
1). Zunächst werden die Proben auf das Vorhandensein bestimmter regulatorischer
DNA-Sequenzen hin untersucht. Bei den
derzeit in der Europäischen Union (EU) für
die Lebensmittelherstellung zugelassenen
GVOs ist zu 80% der Promotor 35S aus dem
Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) verwendet
worden. Daher werden Lebensmittelproben
meistens mit einem solchen „Screening“Verfahren untersucht. Im positiven Fall muß
jedoch eine für die gentechnische Verände-
Identify
Isolate
Fractionate
Characterize
Evaluate
Diagnose
ProteomeLab™ PF2D
Proteinfraktionierung mit zweidimensionaler Chromatographie
• Intakte Proteine in flüssiger Phase
• Differential Display zum Auffinden
von Target Proteinen –
Ideal für Biomarker
• Kein Spot Picking oder Anfärben der
Proteine wie bei Gelen
ProteomeLab™ PA800
Proteincharakterisierung und
Qualitätskontrolle
• Isoelektrische
Fokussierung
• SDS PAGE zur Bestimmung der
molaren Masse
• Glykoprotein Mapping
• IgG Heteregonität von
Antikörpern
Kennziffer 14 LW 035. ·Jahrgang
www.biocom.de
| Nr. 3/2004 | 9
LABORWELT
LW3_04_(08-10)_tg.okok
왘
Abb. 2: Relativer Variationskoeffizient (RSDR) des Roundup Ready-Sojabohnen (RRS)-Nachweises. Als
Grundlage dienten Ergebnisse aus insgesamt 17 Laboren. Der Gehalt an gentechnisch verändertem
Soja lag zwischen 0 und 5%. TVP= texturiertes Sojaisolat
Beckman Coulter GmbH
Europark Fichtenhain B13, 47807 Krefeld
Telefon: 0 21 51/33 3-5, FAX: 0 21 51/33 36 31
E-Mail: bioresearch.de@beckman.com
www.beckmancoulter.com/proteomelab
9
16.06.2004, 15:41 Uhr
B L I T Z L I C H T
Art und Weise ausgedrückt werden. Management-Entscheidungen sollten dann die
angegebene Meßunsicherheit des Ergebnisses mit berücksichtigen.
Tab. 2: Betrachtung von Fehlerquellen
Probe
– Unterschiedliche Degradation von Komponenten
(Lagerung, Prozessierung, enzymatischer Abbau)
– Unterschiedliche Zelldichte pro Gewicht
– Unterschiedliche Kopienzahlen der Ziel-DNA pro Zelle
(Ploidiegrad, multi-copy, reduzierter Chromosomensatz)
– Unterschiedliche Effizienz bei der Extraktion aus verschiedenen Komponenten
– Pipettierfehler bei Verdünnung
– Pipettierfehler
– Gerätefehler (inhomogener Thermoblock, Optik)
– Unterschiedliche Effizienzen
– Inhibitionen in einzelnen Proben
– Mutationen im Primer-Anlagerungsbereich
– Kompetition, sterische Effekte
DNA-Extrakt
PCR-Ansatz
Real-Time-PCR
rung spezifische DNA-Sequenz nachgewiesen werden. Der zweifelsfreie Nachweis eines bestimmten GVO kann bis dato ausschließlich mit Hilfe der „Event“-spezifischen PCR erfolgen, bei der der Übergang
zwischen dem genetischen Konstrukt und
dem Wirtsgenom amplifiziert wird. Nur mit
Hilfe dieses Ansatzes können GVO unterschieden werden, die dasselbe Konstrukt
enthalten.
Für die amtliche Kontrolle ist weiterhin
eine Bestätigung des amplifizierten PCRProdukts mit Hilfe der RFLP, Sequenzierung
oder DNA-DNA-Hybridisierung notwendig.
Theoretisch ist eine einzelne Kopie der
DNA-Zielsequenz ausreichend, um zu einem positiven Ergebnisse in der PCR zu
kommen. Um falsch-positive Ergebnisse
auszuschließen, müssen entsprechende
Kontrollen, wie in Tabelle 1 aufgeführt,
durchgeführt werden. Die im Rahmen der
GVO-Analytik entwickelten Verfahren haben eine Nachweisgrenze (limit of detection,
LOD) von etwa 10 Kopien. Dies entspricht
ungefähr einem Gehalt von 0,01% gentechnisch veränderte Bestandteile in einem Produkt unter Standard-Analysebedingungen.
Einen entscheidenden Einfluß dabei hat –
wie beschrieben – der Prozessierungsgrad.
Je stärker das Produkt bearbeitet wurde, de-
왔
Upgrade your plasmid DNA
°
°
°
°
Service production of certified Research Grade
plasmid DNA
GMP Grade plasmid manufacturing for
clinical applications
CGE analysis and preparative separation of
plasmid topologies
New: Animal free plasmid DNA
production
www.PlasmidFactory.com
Internationale Standardisierung
sto geringer ist der Gehalt an DNA, und somit sinkt auch die praktische Nachweisgrenze in der zu analysierenden Probe. Dadurch
sinkt natürlich die Chance, eine potentielle
gentechnische Veränderung zu identifizieren.
Basierend auf diesem Prinzip sind PCRVerfahren für alle in der EU authorisierten
gentechnisch veränderten Maislinien entwickelt und vom BfR validiert worden4.
Quantitativer Nachweis
Durch die Entwicklung der Real-Time PCR
ist auch die quantitative Bestimmung der
gentechnisch veränderten Bestandteile möglich. Hierbei wird jeweils getrennt der Anteil
gentechnisch veränderter DNA-Sequenzen
und der Anteil der Spezies anhand von Standardkurven bestimmt. Daraus kann der relative Anteil gentechnisch veränderter Bestandteile an einer Zutat bestimmt werden.
Für die Erstellung der Standardkurven werden zertifizierte Referenzmaterialien (certified reference material, CRM) basierend auf
gemahlenem Saatgut verwendet. Diese
CRMs sind für verschiedene GVOs in den
Konzentrationen 0 -5% (w/w) verfügbar (Institute for Reference Material and Measurements, IRMM, Geel, Belgien).
Validierungsstudien sowohl national als
auch international wurden in der Vergangenheit erfolgreich durchgeführt. Dabei
wurden kodierte Proben mit unterschiedlichen GVO-Anteilen untersucht. Es zeigte
sich, daß Abweichungen im Bereich von 25
bis 40% zu beobachten sind (Abb. 2). Wurde
bereits extrahierte DNA an die Teilnehmer
verschickt, lagen die Abweichungen zwischen 15% bis 20%. Dieser auch als Meßunsicherheit bezeichnete Fehler ist daher bei
jeder Analyse mit der validierten Methode
in der Form (x ± b) anzugeben, wobei x den
gemessenen Wert darstellt und b die Meßunsicherheit. Zur Bestimmung der Meßunsicherheit existieren zahlreiche Veröffentlichungen5 (Tab. 2). Auf der letzten Sitzung
des Codex-Komitees für Analyse- und Probenahme (CCMAS) wurde beschlossen, daß
Ergebnisse nur noch in dieser beschriebenen
Im Rahmen des Europäischen Komitees für
Normung (CEN) wurde 1999 eine Arbeitsgruppe gegründet (TC275/WG 11) die Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten standardisiert. Dabei werden Normen
erstellt, die sowohl immunologische Verfahren als auch DNA-basierte Verfahren enthalten. Die erste Norm ist im April 2004 erschienen und beschreibt die Anwendung proteinchemischer Verfahren für den Nachweis von
GVO und gentechnisch veränderten Bestandteilen in Lebensmitteln. Im Anhang des Standards ist beispielhaft eine bereits im Ringversuch validierte Methode zur Identifizierung
der gentechnisch veränderten Roundup Ready-Sojabohne der Firma Monsanto6 aufgeführt.
Abschließend läßt sich sagen, daß bei der
Anwendung der hier beschriebenen Verfahren von „Fehlern“ (Meßunsicherheit) in der
Größenordnung von mindestens 30% auszugehen ist, das heißt der „wahre“ Wert einer Probe 30% höher oder niedriger liegen
kann. Allerdings sind auch andere Analyseverfahren mit Fehlern in dieser Größenordnung behaftet; entscheidend für die korrekte Anwendung ist daher die Berücksichtigung des Fehlers bei anstehenden Entscheidungen.
Literatur
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Clive James. Preview: Global status of commercialized transgenic crops:
2003. ISAAA Briefs No 30. ISAAA: Ithaca, New York.
Verordnung (EG) Nr. 258/97 des Europäischen Parlaments und des Rates
vom 27. Januar 1997 über neuartige Lebensmittel und neuartige Lebensmittelzutaten, Amtsblatt der Europäischen Union L 43 vom 14.02.1997,
Seiten 1 - 7.
Verordnung (EG) Nr. 1829/2003 des Europäischen Parlaments und des
Rates vom 22. September 2003 über genetisch veränderte Lebensmittel
und Futtermittel. Amtsblatt der Europäischen Union L 268 vom 18.10.2003,
Seiten 1 – 23.
Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG;
Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen. Loseblattausgabe, Stand Mai 2004, Berlin, Köln, Beuth Verlag GmbH.
“Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement”, ISO, Geneva,
1993.
EN ISO 21572:2004 „Foodstuffs - Methods for the detection of genetically
modified organisms and derived products - Protein based methods (ISO
21572:2004)“.
Rossen, Lone et al. Inhibition of PCR by components of food samples,
microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. Int J. of Food
Microbiology, 17 (1992) 37-45.
Hermann Broll
Dr. Jutta Zagon
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
Postfach 33 00 13
D-14191 Berlin
eMail: h.broll@bfr.bund.de
eMail: j.zagon@bfr.bund.de
LABORWELT
10 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
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10
16.06.2004, 15:06 Uhr
B L I T Z L I C H T
Automation
왔
Ultraschnelle DNA-Amplifikation
mit Rapid-PCR
Dr. Hanno Hermann, Claus Knippschild, Analytik Jena AG
Die Ansprüche an die Geschwindigkeit, Effizienz und Qualität der Ergebnisse der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind mit der steigenden Anzahl und Vielfalt der Anwendungen dieser Schlüsseltechnologie größer geworden. Die hier vorgestellte, neue Rapid-Cycle-PCR-Technologie ermöglicht jetzt substantielle Fortschritte bei der Einlösung der gestiegenen Anforderungen an die PCR. Neben der Erläuterung der technischen Grundlagen werden hier die
Eigenschaften des „SpeedCycler“-Systems an Anwendungsbeispielen erläutert.
Key Words: PCR, Rapid-PCR, Spezifität, ultradünne Mikrotiterplatten, Speedcycler
Seit der Entwicklung der PCR-Methode 1985
durch Kary Mullis1-2 und seine Mitarbeiter haben stetige Innovationen dazu beigetragen,
daß aus der PCR eine Schlüsseltechnologie
für die biologische Forschung und RoutineDiagnostik geworden ist. Meilensteine dabei
waren etwa der Einsatz hitzestabiler DNAPolymerasen wie der Taq-DNA-Polymerase3
sowie die Entwicklung der Thermocycler, die
eine automatisierte und parallele Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion mit einer Vielzahl von Proben erst ermöglichten.
Von Ende der achtziger Jahre an wurden
kommerzielle Thermocycler entwickelt, die
mit Standard-Mikrozentrifugen-Tubes als
Probenbehälter und temperierten Metallblökken zur Aufnahmen der Tubes arbeiten. Unter den für das Aufheizen und Kühlen des
Blocks genutzten Prinzipien (Wärmelampen,
die relativ geringen effektiven Heiz- und
Kühlraten von 1-2 °C/s innerhalb der Probe,
die durch großvolumige Metallblöcke und
die große Wandstärke der Plastik-Probengefäße (200-300 µm) bedingt sind. Daraus resultieren Zykluszeiten von 3 bis 8 Minuten
und ein Gesamtzeit-Bedarf von zwei bis drei
Stunden für übliche PCR-Experimente.
Da die Ansteuerung der Temperaturzyklen
eine zentrale Rolle in der Polymerase-KettenReaktion spielt, wurde schon bald nach Alternativen mit einer schnelleren Prozeßführung gesucht. Eine Reihe von Reaktoren und
Technologien für schnelle Temperaturführung kleiner Probenvolumina wurde so getestet4-5. Wittwer (siehe LABORWELT 2/2000)
entwickelte ab 1989 eine sehr schnelle Thermocycler-Technologie auf Grundlage der
Temperierung mit heißer oder kühler Luft
Abb. 1: Der Speedcycler als „personal thermocycler“ mit 36-well-Mikrotiterplatte
elektr. Widerstandsheizung, Wasserkühlung,
etc.) hat sich bei den heute geläufigen Thermocyclern fast ausnahmslos die Verwendung
von Peltierelementen durchgesetzt, die eine
robuste und kompakte Bauweise der Geräte
ermöglichen. Ein weiterer Vorteil dieser PCRGeräte ist die Verwendbarkeit von Mikrotiterplatten nach den SBS-Normen 96 oder 384.
Damit ist der Einsatz der üblichen manuellen Pipettiertechnik und der Standard-Automatisierungslösungen für ein PCR-set up
möglich. Als Nachteil erwiesen sich dagegen
und der Verwendung von Glaskapillaren als
Probengefäßen6. Die experimentellen Erfahrungen mit diesem kommerziell verfügbaren
System führten zur Definition der ultraschnellen PCR als „Rapid cycle PCR“ – 30
Amplifikations-Zyklen in weniger als 30 Minuten7. Auf Grund sehr hoher Heiz- und
Kühlraten (> 8 °C/s) dauert ein einzelner
Temperaturzyklus etwa 20 Sekunden, damit
sind PCR-Experimente mit einer Dauer von
rund 15 Minuten möglich. Neben der Verkürzung der PCR-Experimente eröffnete die Ra-
pid-cycle-PCR als weiteren Vorteil eine verbesserte Qualität der PCR-Produkte. Die
durch die schnelleren Kühlraten und kurze
Annealingzeiten erfolgte präzisere Primer–
Template–Paarung bedingt hierbei eine höhere Spezifität der Amplikons. Diese spezielle Rapid-PCR-Technologie weist aber auch
einige Nachteile auf. Das Befüllen der einzelnen Kapillaren erwies sich als relativ kompliziert, die Standard-Pipettiertechnik als mit
dem System nicht kompatibel. Dies limitiert
den Probendurchsatz – eine Automatisierung
der PCR mit marktüblichen Workstations ist
nicht möglich. Die relativ große Oberfläche
der Glas-Kapillaren kann zudem die Komponenten des PCR-Ansatzes adsorbieren. Es
kann also etwa zum Verlust der Enzym-Aktivität oder zur irreversiblen Bindung von
DNA an die Glasoberfläche kommen. Um
diese Effekte zu vermeiden, müssen dem Master-Mix zusätzlich ein Carrier-Protein (BSA)
zugefügt und die Enzymkonzentration optimiert werden.
Peltier-Rapid-PCR
in ultradünnen Mikrotiterplatten
Um neue Applikationen und experimentelle
Wege zu ermöglichen, mußte es das Entwicklungsziel einer neuartigen PCR-Technologie
sein, die positiven Eigenschaften der beiden
beschriebenen Thermocycler-Klassen zu verknüpfen und die Nachteile auszuschalten –
also Schnelligkeit und Automation zu vereinen. Das neue SpeedCycler®-System erreicht
dies durch Kombination eines mit Peltier-Elementen betriebenen Block-Thermocyclers
und einer speziellen ultradünnen Mikrotiterplatte aus Plastikmaterial, deren Probenbehälter entsprechend der SBS-Norm angeordnet sind (Abb. 1). Damit bietet das System
eine Kombination von hoher Geschwindigkeit, Möglichkeit der Nutzung der in allen
Laboren vorhandenen Pipettier- und Automatisierungstechniken und ein gemeinsames
Prozessieren der Proben in Gefäßen aus biokompatiblen Kunststoffen.
Die hohe Geschwindigkeit des Systems
wird durch mehrere technische Merkmale
erreicht. Der Rapid-Thermocycler zeichnet
sich aus durch:
– Die Verwendung von modernen Hochleistungs-Peltierelementen, die einen
– kleinvolumigen Metallblock mit geringer
thermischer Kapazität temperieren.
Die in den Metallblock eingesetzte Mikrotiterplatte zeichnet sich aus durch:
– sehr dünne Wände der Probengefäße
(10fach dünner als Standard-Gefäße) und
– eine hohe Flexibilität der Wandungen während der PCR.
Schnelle Regelalgorithmen steuern Peltierelemente an, die den Rapid-Block fast verzögerungsfrei temperieren. Die für das PCR-Experiment entscheidende Übertragung der
Energie in die Probenlösung erfolgt durch
die dünne Folienwandung sehr effektiv.
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11
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ständig für die chemischen (Denaturieren
des DNA-Doppelstranges) oder biochemischen Prozesse (DNA-Synthese) genutzt
werden (Abb. 2).
Hohe Geschwindigkeit und Spezifität
Abb. 2: Schematischer Vergleich des Temperaturverlaufs eines PCR-Zyklus aus einem 1.000 bp-Protokoll. Standard-Peltier-Thermocycler (blau) 30 s – 30 s – 60 s, Speedcycler (rot) 1 s – 1 s – 10 s (Denaturierung – Annealing – Elongation). Der Rapid-Thermocycler ist durch wesentlich höhere ramprates und
sehr kurze stationäre Temperaturphasen deutlich schneller.
Durch die Termperaturerhöhung nach dem
Start eines PCR-Experimentes baut sich in
der Probenkammer ein Druck auf, der die
flexible Kunststoffwandung an den Metallblock andrückt. Zudem begünstigt die konische Form der Bohrungen im Block und
der einzelnen Probengefäße der Mikrotiterplatte die schnelle Temperierung des PCRReaktionsgemisches. In Summe der hier beschriebenen Effekte, erreicht die „SpeedCycler“-Technologie eine sehr hohe thermische Effektivität. Heiz- und Kühlraten von
deutlich über 8/6 °C/s ermöglichen Zykluszeiten von 20 Sekunden und damit das
Durchführen von PCR-Protokollen mit 30
Zyklen in 10 bis 15 Minuten. Neben den vergleichsweise hohen „ramprates“ des RapidThermocyclers (vgl. Marktübersicht Thermocycler, S. 36 ff.) bestimmen auch die nur
kurzen, notwendigen Haltezeiten in den drei
Temperaturphasen der PCR (Denaturierung,
Annealing, Elongation) die Dauer der Rapid-Protokolle. Während in Standard-Peltier-Thermocyclern ein großer Teil der Zeit
für das Temperieren des Metallblocks und
der Plastik-Wandungen der Probengefäße
benötigt wird, kann die Zeit in den Temperaturstufen im Speedcycler-System fast voll-
Abb. 3: Amplifikation verschiedener Fragmente (100, 200, 536 bp)
des beta-Globingens aus genomischer DNA der menschlichen Placenta. Drei zeitlich unterschiedliche Protokolle (DenaturierungAnnealing-Elongation, in s) wurden mit unterschiedliche Template-Mengen (v.l.n.r. 50ng/10ng/1
ng/100pg/10 pg/blank) gestartet,
um die Effektivität der Varianten
darzustellen.
Entscheidend für den Gebrauchswert eines
Thermocycler-Systems sind nicht allein die
physikalischen Leistungsparameter wie
Heiz- und Kühlraten oder thermische Effizienz. Wichtiger sind die Merkmale des molekularbiologischen Experimentes, wie Dauer des PCR-Protokolls, Ausbeute und Qualität der PCR-Produkte. Insbesondere in der
medizinischen Diagnostik oder bei forensischen Applikationen ist die PCR oft noch der
geschwindigkeitsbestimmender Schritt in einer Abfolge analytischer Methoden. Eine
hohe Spezifität der amplifizierten DNA ist
insbesondere bei der weiteren Verwendung
für Klonierungen oder Sequenzierungen
wünschenswert. Die folgenden experimentellen Ergebnisse wurden mit dem SpeedCycler-System erzielt und zeigen exemplarisch die Vorteile des Systems. Für das Ansetzen der PCR-Reaktionen wurden Standard-Enzyme, -Komponenten und -Puffer in
handelsüblichen Qualitäten von verschiedenen Herstellern eingesetzt. Die Endkonzentrationen der Komponenten im PCR-Mastermix entsprachen ebenfalls normalen PCRAnsätzen. Spezielle Optimierungszusätze
oder die Verwendung von Enhancern waren nicht notwendig, lediglich die übliche
Optimierung der Magnesium-Konzentration für die spezifischen Template/PrimerKombinationen wurde durchgeführt. Von
den Probenvolumina von 10 bis 20 µl pro
well der 36-well-Mikrotiterplatte wurden jeweils Aliquots in der Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Der Auswertung der Ergebnisse sei noch
folgende Betrachtung vorangestellt. Nach einer im Bereich der Standard-PCR genutzten
praktischen Faustregel wird für die Amplifikation eines 1.000 Bp-DNA-Moleküls eine
Elongationszeit von etwa 1 Minute benötigt.
Die hochprozessive Taq-DNA-Polymerase
verlängert aber den DNA-Strang unter optimalen Temperaturbedingungen von 70 °C bis
80 °C um 100 bis 150 Nukleotide/Sekunde.
Selbst bei 50 °C kann noch eine Verlängerungsgeschwindigkeit von 25 Nukleotiden/
Sekunde gemessen werden. Der Unterschied
dieser Konstanten (ca. Faktor 16) ist offensichtlich damit zu erklären, daß im konventionellen Gerätesystem viel Zeit für die Temperierung des Metallblockes und der Probengefäße benötigt wird. Im Rapid-PCR-System
wird die Zeit dagegen effektiv für die Amplifikation genutzt.
In Abbildung 3 ist die Amplifikation von
drei kurzen Fragmenten des menschlichen
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16.06.2004, 15:11 Uhr
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EBSIN-Stand
1
18.06.2004, 10:15 Uhr
B L I T Z L I C H T
Competitor X
5h
AJ SpeedCycler
3,25 h
Abb. 4: Amplifikation eines 5 kbFragmentes aus
Lambda-DNA. Der
Vergleich mit einem StandardThermocycler unter Verwendung
eines StandardProtokolls zeigt
deutlich die höhere
Effektivität der
Amplifikation im
SpeedCycler.
Beta-Globin-Gens auf der Basis von genomischer DNA dargestellt. Mit den gewählten
Primern wird das Globingen als „singlecopy“-Gen amplifiziert, wobei eine Templatemenge von 10 pg etwa drei Kopien entspricht. Wie sich zeigt, ist eine effiziente Amplifikation der Fragmente mit den rund 18minütigen Protokollen möglich. Die Verkürzung
der Elongationszeit von 10 Sekunden vermindert die Ausbeute, aber auch mit einer Synthesezeit von 4 s kann das 536 bp-Fragment
noch dargestellt werden. Offensichtlich kann
das SpeedCycler – Rapid-PCR-System die
Prozessivität der Taq-DNA-Polymerase in
hohem Maße nutzen. Ähnliche Ergebnisse
(hier nicht dargestellt) wurden mit anderen
Amplikons in der Größenordnung 100-200 bp
und sehr kurzen Protokollen (1-1-1, 0-0-0, sec)
erzielt.
Abbildung 4 zeigt die Amplifikation eines
5 kb-Fragmentes der DNA des Phagen
Lambda. Das in diesem Experiment genutzte Thermocycler-Protokoll entspricht mit
den Werten für Denaturierung 45 Sekunden
– Annealing 30 Sekunden – Elongation 5 Minuten – einer Standard-PCR. Der SpeedCycler wurde hierbei mit einem StandardThermocycler direkt verglichen. Im Ergebnis zeigt der SpeedCycler nicht nur einen
schnelleren Verlauf des Experimentes, sondern auch eine deutlich höhere Ausbeute an
PCR-Produkten. Gleichartige Ergebnisse
(hier nicht gezeigt) wurden im Vergleich mit
anderen Standard-Geräten erzielt, wobei die
Verwendung unterschiedlicher Enzym-Präparationen und Reaktionskomponenten zeigen, daß die positiven Ergebnisse tatsächlich auf das Rapid-PCR-System zurückzuführen sind.
Abbildung 5 zeigt den Aspekt einer verbesserten Spezifität der amplifizierten DNA
bei Anwendung der Rapid-PCR-Technolo-
4 kb PCR
Template: Lambda DNA
24 kb PCR
Template: human genomic DNA
gie des SpeedCyclers. In zwei Experimenten wurden ein 4 kb Lambda-DNA-Fragment und ein 24 kb-Fragment aus genomischer DNA (human placenta) jeweils im direkten Vergleich im Speedcycler und in einem Standard-Thermocycler amplifiziert.
Bei der Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese wurden gleiche Mengen an gewünschtem PCR-Produkt aufgetragen. In
beiden Fällen zeigen die Ergebnisse des
Standard-Cyclers deutliche Mengen an Nebenprodukten, die Proben aus dem SpeedCycler enthalten nur das spezifische Amplikon. Da in beiden Experimenten ein Standard-PCR-Protokoll angewendet wurde, ist
die höhere Spezifität der Ergebnisse aus dem
Speedcycler im wesentlichen auf die hohen
Kühlraten des Cyclers zurückzuführen. Die
Gesamtdauer des long-distance-Protokolls
im Standard-Cycler betrug 8 h 22 min im
Vergleich zu 5 h bei Verwendung des SpeedCyclers.
Fazit
Die von der Analytik Jena AG gemeinsam mit
Wissenschaftlern des Hans-Knöll-Instituts
für Naturstoff-Forschung entwickelte Rapid-Cycle-Technologie „SpeedCycler“ ermöglicht die ultraschnelle Amplifikation
von DNA-Fragmenten unterschiedlicher
Größe und Herkunft mit einer deutlich erhöhten Spezifität der PCR-Produkte. Die
Vorteile einer Rapid-Cycle-PCR sind in dem
vorgestellten System mit den Vorteilen aus
der Anwendung der Peltier-Technik und der
Verwendung einer Mikrotiterplatte als Probenträger verknüpft.
Literatur
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[2]
[3]
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Belgrader et al., J. Forensic Science 43 (1998), 315-319
Wittwer, C.T. et al., Nucl. Acid. Res. 17 (1989), 4353-4357
Wittwer, C.T. et al., In Mullis, K. et al. (Eds.), The polymerase chain reaction.
Birkhauser, Boston (1994), 174 -181
Danksagung
Wir danken der Treff AG, Jenabioscience
GmbH und dem Hans-Knöll-Institut Jena
(Arbeitsgruppe Prof. Dr. Hans-Peter Saluz)
für die Zusammenarbeit.
Abb. 5: Amplifikation eines 4 kb-Lambda-Fragments (links) und long-distance-PCR (rechts) eines 24
kb-Fragments aus genomischer DNA. Im Vergleich des SpeedCyclers mit einem Standard-Cycler zeigt
sich in beiden Fällen die höhere Spezifität der PCR-Produkte aus dem Experiment mit dem RapidPCR-Cycler.
Dr. Hanno Hermann
Claus Knippschild
Analytik Jena AG
Konrad-Zuse-Str. 1
D-07745 Jena
Tel.: +49-(0)3641-7770
Fax: +49-(0)3641-779279
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www.analytik-jena.de
LABORWELT
14 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
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14
16.06.2004, 15:12 Uhr
B L I T Z L I C H T
Real-time PCR
BioDigital
왔
2004
al.de
Highly flexible expression
profiling of human genes
igit
www.biod
Peter Mouritzen, Peter S. Nielsen, Nana Jacobsen, Mikkel Nørholm, Christian Lomholt,
Henrik M.Pfundheller, Niels B. Ramsing, Sakari Kauppinen, and Niels Tolstrup,
Exiqon, Vedbaek, Denmark
International Trade Fair
and Conference on
IT and Instrumentation
for Pharmaceutical and
Systems Biology Research
Quantitative real-time RT-PCR has become the method of choice for accurate expression profiling of selected genes and validation of microarray data. The technique is especially suitable for
analysis of low abundant mRNAs and small samples. We report here on a novel concept for
real-time RT-PCR based on the development of a library of pre-validated detection probes, designated as ProbeLibraryTM. The probes have been shortened to only 8-9 nucleotides by substitution with the duplex stabilizing DNA analogue LNA, thereby ensuring adequate compatibility in
standard real-time RT-PCR assays. The use of the short recognition sequences, in turn, makes
it possible to use the same LNA enhanced probe to detect and quantify many different transcripts thereby allowing targeting of the most frequently recurring short sequence tags in the
human transcriptome. By careful selection and validation of the most common 8- and 9-mer
recognition sequences, we have constructed a library of 90 detection probes with a high coverage of 98 % of the human transcriptome in the RefSeq database. On average, each mRNA contains
binding sites for 16 ProbeLibraryTM probes, whereas each detection probe recognition sequence
is found in more than 7,000 of the approximately 38,000 human transcripts in humRefSeq. We
were successful in designing functional real-time PCR-based expression assays for 98% of the
80 most cited mRNA transcripts in the human RefSeq database.
Despite its widespread use in mRNA quantification, real-time RT-PCR is still a complex
technique with many pitfalls associated with
its true specificity, sensitivity and reproducibility1. The design of functional real-time RTPCR assays is both time-consuming and laborintensive. Thus, the time spent on assay design, oligonucleotide synthesis, and assay va-
October 13 - 15, 2004
Messe Freiburg
Freiburg i. Br. - Germany
Bioinformatics
Life Science IT / Software
Platform Technologies for
Drug Discovery
Computing +
IT Platforms / Hardware
Analytical Technologies
Lab Supply / Services
ment of a library of 90 pre-validated real-time
PCR detection probes, designated here as ProbeLibrary™, which have been shortened from
the conventional 20-30 nucleotide DNA detection probes to only 8-9 nucleotides, thereby
allowing targeting of the most frequently recurring short sequence tags in the human
transcriptome. To ensure compatibility with
Figure 1: The coverage of the human ProbeLibrary™.
lidation is often a bottleneck in the development and implementation of new expression
profiling assays for large-scale analyses. Although many commercially available, readyto-use real-time RT-PCR assays are available,
they are expensive and lack flexibility, due to
the fact that they are highly transcript specific
and therefore each transcript requires a different probe. Furthermore, these assays often target single exons or exon-exon splice junctions,
and thus, quantification of mRNA splice variants would require synthesis of several probes. We report here on a novel concept for versatile, real-time RT-PCR based expression profiling of 98% of the human protein-coding
transcripts in the human RefSeq database at
NCBI. The method is based on the developLABORWELT
LW3_04_(15-17)_tg.ok
standard real-time RT-PCR methods, where
annealing and extension is carried out at 60oC,
we have substituted the probes with the highaffinity nucleotide analogue locked nucleic
acid (LNA)2. We have also developed a new
software, ProbeFinder™, which enables fast
design of optimal real-time PCR assays for
gene expression analysis by combining the
ProbeLibrary™ probes with target-specific
PCR primers selected using the Primer3 software. The specificity of each real-time RT-PCR
assay relies on the combination of gene-specific PCR primes and the selected ProbeLibrary™ detection probe, thus avoiding the many
Partners
Organizers
왘
5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 15
Messe Freiburg
15
16.06.2004, 15:23 Uhr
B L I T Z L I C H T
Fig. 2: Design of real-time RT-PCR assays using the ProbeFinder™ software. The software designs real-time PCR assays for the entered nucleotide sequence and displays each assay in a table format by the ProbeLibrary™ probe identifier and the primer pair. An overview of the transcript is given with the
intron positions and the ProbeLibrary™ assays indicated along with the mRNA sequence. In addition, a detailed view of the real-time PCR assays depicts the
positions of the PCR primers as well as the detection probe binding sites within each PCR amplicon.
problems associated with unspecific real-time
PCR assays, such as SYBR Green assays.
Chemicals and reagents
The following Assay-on-Demand™ gene expression products from Applied Biosystems
were used: Hs00184491_m1 ABCB1 for human
MDR gene; Hs00233463_m1 for human
ALOX5AP gene; and Hs99999905_m1 for human GAPDH, together with TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG and
SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA). All assays were performed according to the manufacturer’s instructions. In
addition the following reagents were used in
the study: QuantiTect Probe PCR Master Mix
(Qiagen, USA); the ROX Reference Dye and
SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA), Quantitative PCR Human Reference Total RNA (Stratagene, USA), and human ProbeLibrary™ detection probes (Exiqon,
Denmark).
mix (Qiagen, USA) according to the manufacturers’ instructions with a primer concentration of 0.2 µM and ProbeLibrary™ detection
probe concentration of 0.1 µM. The real-time
PCR assays were carried out on an ABI Prism
7000 using an enzyme activation step of 7 minutes at 95°C, followed by 40 cycles of PCR
with a 20 second denaturation step at 94°C and
a 1 minute extension step at 60°C.
Data analysis
The performance of assays was validated on
the following parameters: shape of the realtime PCR plots, development of fluorescence,
the derived cycle threshold (Ct) value, and
end-point analysis by gel electrophoresis for
Real-time RT-PCR
The real-time RT-PCR assays were designed
using the ProbeFinder™ software, accessible
at www.probelibrary.com. A standard method for
first strand cDNA synthesis was used employing 1 µg of a human total RNA pool of 10
cell lines (Quantitative PCR Human Reference
Total RNA, Stratagene, USA), random hexamer primers and SuperScript II reverse transcriptase. Following spin column purification,
the volume of the cDNA preparation was adjusted to 100 µL per 1 µg input total RNA and
1 µL used as template in the real-time PCR reactions. The real-time RT-PCR assays were
performed in triplicate in a 50 µL reaction volume using QuantiTect™ Probe PCR master-
Fig. 3: Comparison of ProbeLibrary™ realtime RT-PCR assays with TaqMan™ Assay-ondemand™ assays. Real-time PCR amplification plots for human GAPDH (triplicates) derived
from five 10-fold serial dilutions of the same
human template cDNA pool, performed on the
ABI PRISM 7000. The ProbeLibrary™-based
amplification plots are depicted in red and Assay-on-Demand™-based plots in green.
yield estimation and confirmation of amplicon size. Assays were categorized as having
failed (i) if no increase in fluorescence (∆F) was
observed, (ii) if the real-time PCR amplification plot had a non-sigmoid shape, (iii) if the
amplicon size was incorrect, (iv) if more than
one amplicon was generated, or (v) if the PCR
product yield was too low. The data (Rn and
Ct values) were exported to Excel for further
analysis to produce calibration curves and to
calculate PCR efficiencies.
Results and Discussion
Large-scale expression analysis is increasingly
important in many areas of biological research
aiming at deciphering complex biological systems, thereby greatly facilitating the understanding of basic biological processes as well
as human disease. Quantitative real-time RTPCR has become the method of choice for accurate expression profiling of selected genes
and validation of microarray data, and is especially suitable for analysis of low abundant
mRNAs and small samples1,3. However, realtime RT-PCR is often hampered by the labourintensive assay design and validation, which
significantly lowers its throughput compared
to genome-wide expression profiling by DNA
microarrays. In response to this, we have developed a new method based on the development of a library of 90 pre-validated real-time
PCR detection probes, which target the most
frequently occurring short sequence tags in the
human transcriptome. As demonstrated it is
possible to reduce the length of real-time RTPCR probes to only 8-9 nucleotides given the
significantly increased duplex thermal stability of LNA substituted probes. In turn, the use
of the short recognition sequences makes it
possible to use the same LNA-enhanced proLABORWELT
16 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
LW3_04_(15-17)_tg.ok
16
16.06.2004, 15:27 Uhr
B L I T Z L I C H T
be to quantify many different transcripts. On
average, each mRNA contains binding sites for
16 ProbeLibrary™ probes, whereas the recognition sequence of each detection probe is
found in more than 7,000 of the 38,556 human
transcripts in the RefSeq database at NCBI. In
total, 98% of the RefSeq transcripts are targeted by at least one probe and 90% of transcripts are targeted near an exon-exon junction
according to Ensembl gene structure predictions (Fig. 1). The latter enables design of intron spanning assays, eliminating amplification of genomic DNA that may contaminate
RNA samples. Based on the Ensembl gene
structure prediction, our calculations showed
that 35% of all exons in human transcripts are
targeted by a probe, and for a number of genes this may facilitate design of assays for different splice variants.
A new software, ProbeFinder™ (access at:
www.probelibrary.com), enables design of realtime PCR assays for gene expression analysis
by combining the ProbeLibrary™ detection
probe concept with target-specific PCR primers selected using the Primer3 software (Fig.
2). Once the mRNA of interest has been entered into the ProbeFinder™ program, the software identifies the intron positions and selects the ProbeLibrary™ probes and primer
pairs for each real-time PCR assay. The intron
positions are identified within the transcript
with the aim of designing amplicons that span
exon-exon splice junctions for real-time PCR
assays, either by prediction, a look-up in Ensembl or by the positions marked in the mRNA
sequence.
To compare the sensitivity of ProbeLibrary™-based real-time RT-PCR assays with those of the Applied Biosystems Assay-on-DemandTM assays, 10-fold serial dilutions of the
same human first-strand cDNA pool were
used as templates for human GAPDH realtime PCR. The data obtained with the two
detection systems revealed nearly identical
amplification plots and Ct values (Fig. 3), indicating that the performance of the two assay types is highly comparable. Similar results, including SYBR Green real-time PCR data,
were obtained for the human MDR1 and the
ALOX5AP transcripts (results not shown).
Next, we assessed the success rate of ProTab.: Evaluation of 80 human ProbeLibrary™based real-time PCR assays designed by the
ProbeFinder™ software.
Assay Category
Result
782)
Successful assays1)
Total number of failed designs
23)
Total number of validated assays
80
Assay Design Success Rate:
98%
1)
Real-time PCR plot sigmoid, fluorescence signal ample, and a single amplicon
of correct size, 2) 6 of these assays were successful in a second round in which
another assay was selected from the list of assays suggested by ProbeFinder‘.
3)
Low or insignificant amount of amplicon / No increase in fluorescence
beLibrary™ based real-time RT-PCR by designing expression assays for the 80 most cited
mRNA transcripts in the human RefSeq database. The RefSeq transcripts were selected
from the top of a list generated by sorting the
RefSeq entries according to the number of literature citations within these. The assays were
designed by submitting the mRNA RefSeq
sequence IDs to the ProbeFinder™ software
with the intron spanning assay feature enabled in the software in order to obtain splice
junction spanning PCR amplicons. Of the individual assays designed for 80 different human mRNAs, a total of 78 were successful –
72 of these in the first real-time PCR run –
which equals to an assay success rate of 98 %
(see Table). This clearly shows that the Probe-
Kennziffer 18 LW 03 · Informationen ordern? · www.biocom.de
Library™ probes combined with the ProbeFinder™ design software provide a robust expression profiling platform useful for high-throughput expression analysis.
In conclusion, the results presented here
demonstrate that the ProbeLibrary™ assays
perform equally well in real-time PCR compared to Assay-on-Demand assays, while simultaneously providing a more flexible platform, since a library of 90 detection probes can
be used to cover the entire human transciptome. On the other hand, the ProbeLibrary™
assays exhibit high assay specificity avoiding
the possible problems with primer dimer-derived fluorescence, often associated with SYBR
Green real-time PCR assays. In the present study we were successful in designing functional real-time PCR-based expression assays for
98 % of the 80 most cited mRNA transcripts in
the human RefSeq database at NCBI. On average each transcript in the RefSeq database is
targeted by 16 probes in the ProbeLibrary™,
and thus, a failed real-time PCR assay was
easily replaced by selecting an alternative assay suggested by the ProbeFinder™ software.
References
[1]
[2]
[3]
Bustin SA, 2000. J. Mol. Endocrinol. 25: 169-193.
Koshkin AA, Singh SK, Nielsen P, Rajwanshi VK, Kumar R, Meldgaard M,
Olsen CE and Wengel J, 1998. . Tetrahedron 54: 3607–3630.
Liss B, 2002. Nucleic Acids Res. 30 (17) e89.
Contact
Peter Mouritzen, Ph.D., Manager
Department of New Technologies, Exiqon
Bygstubben 9,
DK-2950 Vedbaek, Denmark
Phone: +45-45-65040888
Fax: +45-45-661888
eMail: pm@exiqon.com
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LABORWELT
LW3_04_(15-17)_tg.ok
17
16.06.2004, 15:56 Uhr
| 17
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18
Molekulare Genetik und Biotechnologie •
Qualitätskontrolle in der Brauerei •
Zellkommunikation
Wechselbare 1- nd 8-Kanal-Pipettiertools •
Funktionsprinzip Handpipette • integriertes Washtool
• Nukleinsäureaufreinigungen mit Vakuumsystemen
oder Magnetic Beads im 96er-Format
Je nach verwendetem Kit für 96 DNA/RNAIsolationen 40-85 min, maximal 3-10 Platten pro Tag
• PCR-Produkte und SequenzierreaktionsAufreinigungen je nach Kit für 96 Reaktionen 20-60
min, maximal 6-15 Platten pro Tag
Kits verschiedenster Hersteller sind automatisiert.
Komplette Applikationen stehen für die Filtration
oder Magnetic Bead-Separation zur Verfügung. Die
RNA- und DNA-Qualitäten sind typischerweise
besser im Vergleich zur manuellen Abarbeitung der
verschiedenen Kits
Deckoberfläche frei konfigurierbar
4. Einsatzgebiet
5. Arbeitsprinzip
6. Durchsatzbereich/Durchsatz pro Tag
7. Beschreibung Kit (Prinzip/Einsatzbereich/
DNA o. RNA-Qualität etc.)
8. Beschreibung Robotiksystem
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16.06.2004, 16:05 Uhr
Steuerung durch Biomek-Software • CFR 21 Part 11konform • Datenbank (SQL) im Softwarelieferumfang
• Integration von Photometern, Thermocyclern, Rührund Schüttelpositionen, Vakuumpumpen und
Stackern sind optionale Standards
Gleichzeitiger Einsatz von verschiedenen
Pipettiertools in einer Methode • 1- und 8- KanalTools stehen in 1 ml, 200 µl sowie 20 µl zur
Verfügung (Pipettier-volumen 0,5-1000 µl) •
Flüssigkeitsoberflächen-erkennung mit Ultraschall •
Kontaminationsfreiheit durch Verwendung von
Disposable Tips • paßt in Standard-Laminar-FlowWerkbänke
105.000,– g
8.5 Einsatzmöglichkeiten
9. Service/Anzahl Servicetechniker Deutschland? 26 Servicetechniker in Deutschland
Preis je nach Ausstattung von 65.000,– g bis
10. Basispreis (Euro)
8.4 Steuerung
8.2 Ortsauflösung
8.3 Liquid-Handling-Werkzeuge
Röhrchen in allen Größen, Mikrotiterplatten-Formate
von 6-384 well
Je nach Achse 0,01-0,001 mm
Offenes automatisches Pipettiersystem
3. Kurzbeschreibung des Produktes
8.1 Probengefäße
Biomek NX, Biomek FX
Biomek 3000
2. Produktname
Dr. Katharina Stein
GE Healthcare - Bio-Sciences
Amersham Biosciences Europe GmbH
Tel.: +49-(0)761-4903-490, Fax: -4903-405
eMail: cust.servde@amersham.com, www.gehealthcare.com
Grundgerät für einen Volumenbereich: 68.000 g • 27-9601-02, 250 Aufreinigungen, 255 g
Zusatzausstattung für 2. Volumenbereich: 15.000 g 25-6902-01, 10x96-well plates, 1.405 g
Biomek NX von 70.000,– g bis 130.000,– g
Biomek FX von 115.000.,– g bis 275.000,– g
Technical Support in FreiburgTel./eMail s.o.
2
26 Servicetechniker in Deutschland
chemagic Magnetic Separation Module I
chemagen Biopolymer-Technologie AG
Arnold-Sommerfeld-Ring 2
D-52499 Baesweiler
Tel.: +49-(0)-2401-805500, Fax: -805519
www.chemagen.com, info@chemagen.com
GFX Micro Plasmid Prep Kit 27-9601-02 •
GFX96 PCR Purification Kit, 96 well, 25-6902-02
Offene automatische Laborpipettiersysteme
Innovativer Magnetseparator zur Nukleinsäure- und Vorgepackte GFX (Glasfasermatrix)-Säulchen zum
Proteinpräparation mittels Magnetpartikeln
Gebrauch in der Tischzentrifuge, bzw. 96-well plateFormat zum Einsatz in 96-well plate-Zentrifugen •
Aufreinigung nach dem Prinzip der modifizierten
alkalischen Lyse mit anschließender chaotroper
Salzbehandlung. Elution erfolgt in Niedrigsalz-Puffer
Pharmascreening • Molekulare Genetik und
Probenvorbereitung mittels Magnetpartikeln bei
Zur schnellen Extraktion von Plasmid- oder CosmidBiotechnologie • Zellkommunikation (Caspase,
extremer Flexibilität der eingesetzten
DNA aus E. coli. Eluierte DNA einsetzbar in PCRInterleukine)
Probenvolumina von 1 µl bis 10 ml und bei hoher Amplifikation, Restriktionsverdau, Subklonierung,
Geschwindigkeit • DNA- und mRNA-Aufreinigung Transformation oder Labelling
aus unterschied-lichsten biologischen
Probenmatrices • Auch Proteinaufreinigung
möglich
Biomek NX: 8-Nadel/Wegwerfspitzen (Span-8) oder Besonders effizient durch automatisierten Transfer Zell-Lyse mit Lösungen I-III, Zentrifugation in Mikrofuge,
96/384 Multichannel Pipettierkopf • Biomek FX (ein ausschließlich von Magnetpartikeln statt
Lysat wird anschließend an die Matrix gebunden, Matrix
oder zwei Pipettierarme): Kombinationen aus 8Flüssigkeiten • Separationsstangen separieren und waschen, Elution der DNA mit Wasser oder
Nadel/Wegwerfspitzen und/oder 96/384 Multichannel- verteilen Magnetpartikel in vorgelegte Proben- und Niedrigsalzpuffer
Pipettierkopf • Nukleinsäure-Aufreinigungen mit
Wasch-flüssigkeiten. Stangen dienen gleichzeitig
Vakuumsystemen oder Magnetic Beads im 96/384er- als Magnete sowie als Rührer. Durch einen
Format
Elektromagneten wird das Magnetfeld der Stangen
ein-/ausgeschaltet. Neues, patentiertes Verfahren.
Je nach verwendetem Kit und Geräteausführung für Zeiten je nach Probenart.
Durchsatzbereich ist zentrifugenabhängig: z.B. 18
96/384er-DNA/RNA-Isolationen 20-85 min von 3 bis 96 Proben parallel in 15-35 Min., z.B. für Blutprobe- Aufreinigungen pro 30 min.• Im 96-well-Format sind 96
maximal 60 Platten pro Tag je nach Biomeknvolumina 1 µl bis 300 µl, bis ca. 4.000 Proben/Tag Aufreinigungen in <15 min durchführbar
Ausstatt-ung und verwendetem Kit • PCR-Produkte • 12 Proben parallel in 30-45 Min., z.B. für
und Sequenzierreaktions-Aufreinigungen je nach Kit Blutproben-volumina bis zu 10 ml, bis ca. 148
und Biomek-Ausstattung und für 96/384erProben/Tag
Reaktionen 20-60 min, 6- maximal 100 Platten pro
Tag
Kits verschiedenster Hersteller sind automatisiert.
Kits auf Basis von Magnetpartikeln zur Bearbeitung Plasmidaufreinigung mit konsistenter Ausbeute und
(Komplette Applikationen stehen für die Filtration
fol-gender Probenmaterialien: Vollblut (frisch,
Reinheit. Ausbeute liegt bei 3-6 µg DNA pro isoliertem
oder Magnetic Bead-Separation zur Verfügung). Die gefroren, „buffy coats“, Filterkarten);
ml einer Übernachtkultur. Die A260/A280 Reinheit
RNA- und DNA-Qualitäten sind typischerweise
Wangenabstriche (buccal swabs), tierische Gewebe beträgt 1,7-1,9.
besser im Vergleich zur manuellen Abarbeitung der (inkl. Mausschwanz), Pflan-zengewebe;
verschiedenen Kits
Nahrungsmittel (GMO-Food); Plasmide; PCRProdukte; Sequenzierprodukte; Bakterien (genom.
DNA) • Präparation von mRNA u. simultan viraler
DNA und RNA aus Serum- o. Plasmaproben (200
µl -10 ml)
Deckoberfläche frei konfigurierbar
96 Proben werden parallel bearbeitet
HTS-tauglich
(Probenvolumina von 1 µl-300 µl) • bei
•
Probenvolumen von 0,4-10 ml werden 12 Proben
parallel prozessiert • Wechsel der Formate
Auflösung in allen Achsen 0,001 mm
innerhalb weniger Minuten möglich • Verwendung
gängiger Standard-Probengefäße (96er Low WellGleichzeitiger Einsatz von Nadeln und
und Deep Well-Platten, 5-50 ml Proben-röhrchen)
Wegwerfspitzen bei Span-8-Systemen möglich.
Multichannel-Pipettierköpfe arbeiten mit 250 µl, 30 µl senkt Verbrauchsmittelkosten • Zusätzliche
oder 20µl Disposable Tips (Pipettiervolumen 0,3-1000 Schutzfunktion gegen Kreuzkontamination. • Bedienerfreundliche Software • Offene Architektur zur
µl), Flüssigkeitsoberflächenerkennung über
Anbindung an gängige Liquid-Handling-Roboter
kapazitive Feldmessung • Kontaminationsfreiheit
ermöglicht Aufbau komplexer Robotik-Straßen,
durch Verwendung von Disposable Tips
Routinean-wendungen mit Systemen von zwei
(Tipwaschstation integrierbar), Einhausungen ( EN
12469, ISO 14644, VCI 2083) für die verschiedensten markt-führenden Herstellern liegen vor
Modelle erhältlich
Steuerung durch Biomek-Software • CFR 21 Part 11konform • Datenbank (SQL) im Softwarelieferumfang
• Integration von Photometern, Thermocyclern, Rührund Schüttelpositionen, Vakuumpumpen, Stackern
und Inkubatoren sind optionale Standards
Europark Fichtenhain B13
D-47807 Krefeld
Ansprechpartner: Dietmar Janke
Tel.: +49-(0)-02151-3335
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Ansprechpartner: Dietmar Janke
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1. Firmendaten, Ansprechpartner
M A R K T Ü B E R S I C H T
Marktübersicht: DNA-Aufreinigung
LABORWELT
LW3_04_(18,20-24)_tg.okokok
21
Microarrayanwendungen, Sequenzierung,
Klinische und molekular-biologische Forschung
klinische, molekularbiologische und forensische
Diagnostik, Veterinärmedizin,
Lebensmittelanalytik
MSB-Technologie kombiniert Vorteile eines
schnellen Verfahrens mit hohen Rückgewinnungsraten hochreiner PCR-Produkte •
Aufreinigung von PCR-Produkten ohne Waschen
und Trocknen • Rückgewinnungsraten nahezu
unabhängig von Additiven, dem PCR-Volumen und
der Fragmentgröße für ultra-HTS-Anwendungen
geeignet • Kit ist geeignet für Gebrauch auf
InvisorbVacuum Manifold, Zentrifuge oder auf
Robotern
Zentrifuge: ca. 15 min für 4x96 Präparationen •
Vakuum: ca. 10 min für 1x96 Präparationen •
Roboter ca. 10 min für 1x96 Präparationen
MSB-Technologie • Aufreinigung/Konzentrierung
von PCR-Produkten ohne Wasch- und Trockungsschritt mit flexiblem Elutionsvolumen • Ausgangsmaterial: Amplifizierte DNA-Fragmente
(80bp - 30kb) • Rückholrate 90% • Zeitdauer: 1015 min • Downstream: Sequenzierung,
Microarray-Anwendungen, Klonierung,
Hybridisierung, Labeling
Biotech, Pharma, akademische Forschung, Veterinär, Forensics etc
Liquid Handling-Workstation basierend auf dem Air DisplacementPipettier-Prinzip – ohne Systemflüssigkeiten und Schlauchsysteme
Microlab STAR mit 8 Pipettierkanälen: 8-16 Platten pro Tag (je nach
Applikation) • Microlab STARlet: mit 4 Pipettierkanälen 4-10 Platten pro
Tag (je nach Applikation)
Plasmid-DNA-Aufreinigung • PCR-Aufreinigung • Genomische DNAIsolierung aus Blut und Gewebe • RNA-Aufreinigung • Automatisierung
von Kits verschiedener Hersteller möglich
4. Einsatzgebiet
5. Arbeitsprinzip
LABORWELT
16.06.2004, 16:05 Uhr
9. Service/Anzahl Servicetechniker Deutschland?
8.4 Steuerung
8.2 Ortsauflösung
8.1 Probengefäße
Röhrchen verschiedener Größe oder DW-Platten für gDNA-Isolierung aus
Blut • Eppendorf Cups oder MTP für RNA-Isolierung aus Gewebe oder
Zellen •
Positioniergenauigkeit in X-Y-Z: 0,1mm
Anzahl Pipettierkanäle (STAR): 4,8, 12 oder 16 mit Option für 96erPipettierkopf • Anzahl Pipettierkanäle (STARlet): 4 oder 8 •
Volumenbereich: 0,5ul – 1ml • Pipettierprinzip: Air Displacement-System
ohne Systemflüssigkeit und Schlauchsysteme • Gleichzeitiger Einsatz von
Tips und Stahlnadeln ist möglich dank CO-RE-Technologie • Liquid Level
Detection (LLD): sowohl kapazitive als auch druckbasierende LLD an jedem
einzelnen Kanal • Einzelkanalantrieb: freie Positionierung jedes Kanals in
y- und z-Richtung • Waschstation: erhältlich mit drei voneinander unabhängigen Waschmodulen für ein kontinuierliches Pipettieren ohne
Wartezeiten während des Waschens • Schutz vor Kreuzkontaminationen:
dank weicher Tipaufnahme und -abgabe mit CO-RE-Technologie praktisch
keine Verschleppung, falls sehr kritisch, können zusätzlich Filtertips
verwendet werden • Integration in Laborumgebungen: Fremdgeräte (Bsp.
Reader, Cycler, Platesealer etc.) können entweder mit internem Greifarm
oder zusätzlichem externem Greifarm integriert werden
Ansteuerung von Fremdgeräten wird in Hamilton-Software integriert •
Integration in LIMS-Systeme ist möglich über Filehandling (Bsp. Excel
Tabellen, Access, Text-Dateien etc.)
zusätzliche Applikationen: PCR Setup, Sequenzierreaktionen, DNA-Verdau,
Beladung von Gelen
5 Personen
5 Mitarbeiter im Servicebereich
Microlab STARlet ab 43.000 g
Zentrifuge for 2x96 preps 75 g • Vakuum for 2x96
Microlab STAR ab 72.000 g
preps 57 g • Roboter for 2x96 preps 57 g • bis
zu 50x96 preps lieferbar
für die parallele Aufreinigung und /oder Konzentrierung von 96 PCR-Produkte (80bp-30kb) von
Nukleotiden, Primern, Additiven, Enzymen,
Mineralölen, Puffern und Salzen in 10-20 min
ohne Wasch- und Trocknungsschritt
Invisorb RNA Cell HTS Kit
MSB HTS Rapace
Microlab STAR und Microlab STARlet
Liquid Handling-Workstations mit 4-16 unabhängig positionierbaren
Pipettierkanälen und optionalem 96er-Pipettierkopf
2. Produktname
5 Mitarbeiter im Servicebereich
Zentrifuge for 2x96 preps 372 g • Vakuum for
2x96 preps 358 g • Roboter for 2x96 preps 365
• bis zu 24x96 preps lieferbar
Invisorb RNA Cell HTS kombiniert ein extrem
schnelles Verfahren mit hohen reprodzierbaren
Ausbeuten an hochreiner total-RNA. Der mit
DNA beladene Träger wird nach der Lyse
mittels einer Prefilterplatte vom RNA-haltigen
Lysat abgetrennt. Anschließend RNA-Gewinnung • kurze Präparationszeiten • hochreproduzierbare Ausbeuten – gute RNA-Qualität •
geeignet für Gebrauch auf Invisorb Vacuum
Manifold, Zentrifuge oder auf Robotern
Zentrifuge: ca. 30 min für 1x96 Präparationen
Vakuum: ca. 40 min für 1x96 Präparationen
Roboter: ca. 50 min für 1x96 Präparationen
Invisorb-Technologie • Isolierung hochreiner
RNA frei von genomischer DNA, ohne DNase •
Verdau mit hohen und reproduzierbaren Ausbeuten • Ausgangsmaterial: (50 - 5 x 105)
humane oder tierische Zellen • exzellente
Qualität: A260:A280; 1,8-2,0 • Ausbeute: (1 x
105Zellen ) NIH 3T3 6,5 µg; MRC ,1µg • Zeitdauer: 30–50 min • Downstream: quantitative
RT-PCR (einschl. TaqMan-Analysen, Light Cycler
etc. Expressionsprofiling, Knock-out-Studien,
Targetvalidierung, HTS-Drug-Screening
Klinische, immunologische, onkologische und
molekularbiologische Forschung, Expressionsprofiling, Knock-out-Studien, Targetvalidierung
einfach zu handhabendes und optimiertes
System für parallele Isolation von qualitativ
hochwertiger total-RNA aus 96 Proben
humaner bzw. tierischer Zellinien (50 - 5 x 105)
in nur 30min und ohne DNase-Verdau
Invitek Gesellschaft für Biotechnik und Biodesign
Robert-Rössle-Str. 10, D-13125 Berlin
Tel.: +49-(0)30-9489-3796
Fax: +49-(0)30-9489-3795
eMail: info@invitek.de, www.invitek.de
Ansprechpartnerin: Dr. Ockhardt
Invitek Gesellschaft für Biotechnik und Biodesign
Robert-Rössle-Str. 10, D-13125 Berlin
Tel.: +49-(0)30-9489-3796
Fax: +49-(0)30-9489-3795
eMail: info@invitek.de, www.invitek.de
Ansprechpartnerin: Dr. Ockhardt
Hamilton Deutschland GmbH
Fraunhoferstr. 17, D-82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)-89-552649-0, Fax: +49-(0)-89-552649-10
eMail: info.de@hamiltonrobotics.com
www.hamiltonrobotics.com
Ansprechpartner: Jürgen Dierdorf
NucleoSpin Extract II, 10 Präparationen, 19.g, 50 Präparationen, 70.-g, 250 Präparationen,
319.- g
2 Applikationen in 1 Kit, nur 1 Puffer für PCR
Clean-up und Extraktion von DNA-Fragmenten
aus Agarosegelen, vollständige Entfernung von
Primern, hohe DNA-Wiederfindungsrate (> 90
%) sogar für sehr kleine DNA-Fragmente (≥ 65
bp), reduziertes Elutionsvolumen (15 µl),
Kompatibilität zu den gängigen PCR-Systemen,
schnelles Verfahren
NucleoSpin Extract II für PCR Clean-up und
Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erlaubt die quantitative Extraktion sehr
kleiner DNA-Fragmente (≥ 65 bp) und ein
Aufkonzentrieren der DNA-Eluate (reduziertes
Elutionsvolumen, 15 µl). Neben Verkürzung der
hands-on-time und Kompatibilität zu den
gängigen PCR-Systemen erfolgt eine vollständige Entfernung der Primer selbst von
kleinen PCR-Fragmenten. Einsatzgebiet: PCRClean-up und Extraktion von DNA-Fragmenten
aus Agarosegelen
DNA-Bindung an eine speziell behandelte
Silikamembran unter Verwendung eines darauf
optimierten Bindungspuffers (chaotropes Salz).
Effiziente Entfernung von Kontaminanten durch
nur einen Waschschritt. Elution der DNA unter
Niedrigsalzbedingungen.
NucleoSpin Extract II
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Technischer Support Bioanalytik
Neumann-Neander-Straße 6-8, D-52355 Düren
Tel.: +49-(0)-2421-969-270 oder -275
Fax: +49-(0)-2421-969 -279
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DNA-AUFREINIGUNG
| 21
LW3_04_(18,20-24)_tg.okokok
Xiril Robotic Workstations
NucleoSpin RNA II
2. Produktname
22
Isolierung von DNA und RNA aus verschiedensten Ausgangsmaterialien
Magnetic bead-Separation bzw. Festphasenextraktion
5 bis 10 96 well-Platten/Tag
Isolation von hochreiner, hochmolekularer genomischer DNA, von
Plasmid-DNA sowie von Total-RNA im 96-well-Maßstab; DNA und RNA
direkt für sämtliche Nachfolgeanwendungen einsetzbar, wie z.B. PCR,
RT-PCR und Real Time-RT-PCR
Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen und Gewebe
RNA-Bindung an eine speziell behandelte Silikamembran unter Verwendung eines darauf optimierten Bindungspuffers (chaotropes Salz).
Entfernung von genomischer DNA durch DNase I-Behandlung direkt auf
der Silikamembran sowie Entfernung der Kontaminaten durch spezifische
Waschpuffer
NucleoSpin RNA II ist auch im 8-wellund 96-well-Format sowie als
Midi-Kit erhältlich.
NucleoSpin-Filter zur Homogenisierung und Reduktion der Viskosität von
Lysaten enthalten • quantitative Entfernung von genomischer DNA durch
Behandlung der Silikamembran mit einem Puffer zur Membranentsalzung
und somit optimierter, nachfolgender DNase I-Behandlung • DNase I und
zugehöriger Reaktionspuffer sind im Kit enthalten • bis zu 70 µg direkt
verwendbarer Gesamt-RNA, A260/280: 1.9-2.1 • Bindungskapazität: 100 µg
RNA • Elutionsvolumen: 40 - 120 µl (empfohlen: 60 µl) • hands-on-time:
< 30 min/6 Präparationen • RNA aus bis zu 5x106 oder nur 10 kultivierten
Zellen, 30 mg Gewebe • RNA direkt einsetzbar in gängigen
Nachfolgeapplikationen wie RT-PCR, TaqMan-Analyse, Blotting, Microarray
4. Einsatzgebiet
5. Arbeitsprinzip
22 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
18.06.2004, 10:47 Uhr
bis zu 4 Pipettierkanäle/Arm mit 2-250 µl- bzw. 10-10.000 µl-Pumpen
erhältlich; für abwaschbare Stahlspitzen und/oder Einwegspitzen; 96erKopf ab Herbst 2004; Flüssigkeitserkennung durch Drucksensor;
Einzelkanalbetrieb möglich; Kanäle mit verstellbaren Spitzen-Abständen;
Flüssigkeitsstand- und Klümpchen-Erkennung unabhängig für jeden
Kanal
2–6 Hochgeschwindigkeits-CAN bus-Schnittstellen zur FremdgeräteIntegration; Steuerung über Lirix-Software-Paket (basierend auf MS C++
und MS VisualBasic)
Vorbereitung von PCRs, Sequenzierungen und anderen Reaktionen,
Nukleinsäure-Extraktion, Umpipettierungen, Verdünnungen und VorVerdünnungen, Aliquotierung, Archivierung, Mischen von Flüssigkeiten
u.v.m.
8.4 Steuerung
NucleoSpin RNA II, 20 Präparationen, 76.-g, 50 Präparationen, 180 g, 250 Grundgerät ohne Zubehör ab 22.300,– g
Präparationen, 786 g • NucleoSpin 8 RNA, 12 / 60 x 8 8-well strips, 320.g / 1.399.- g • NucleoSpin 96 RNA, 2 / 4 / 24 x 96-well Platten, 525.- g/
960.- g/ 5.222.-g
vor Ort/ 2 Servicetechniker
± 0.2 mm bei X/Y/Z
8.2 Ortsauflösung
variabel (z.B. 0,2 ml Tubes, 96 well-Platten, 384 well-Platten, Falcons)
8.1 Probengefäße
Kostengünstige Hochleistungsroboter für Nukleinsäure-Aufreinigung und
weitere Applikationen. Vereinigen solide Technologie, hohe Präzision und
größtmögliche Flexibilität
NucleoSpin RNA II zur Extraktion von Gesamt-RNA aus Zellen und
Gewebe inklusive Vorfiltration des Lysates (Homogenisierung, Reduktion
der Viskosität) und optimierter DNase I-Behandlung direkt auf der
Silikamembran (Vorfilter und DNase I im Kit enthalten).

PEQLAB GmbH
Carl-Thiersch-Str. 2 B
D-91052 Erlangen
www.peqlab.de
Ansprechpartner: Dr. Karin Kriener
Tel: +49 (0)9131-610 70 20, Fax: +49 (0)9131-610 70 99, info@peqlab.de
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Technischer Support Bioanalytik
Neumann-Neander-Straße 6-8
D-52355 Düren
Tel.: +49-(0)-2421-969-270 oder -275
Fax: +49-(0)-2421-969 -279
eMail: tech-bio@mn-net.com
www.mn-net.com
Ab 29,– g/mg
Technischer Service für EU und DE in Bielefeld (Tel.: 0521 299 7350)
Maßstab nach Bedarf (1 mg bis 25 g)
Service (ähnlich Sequenzierservice: Kunde schickt eine kleine Probe der
Plasmid-DNA und PlasmidFactory produziert die gewünschte Menge,
portioniert sie im Puffer der Wahl des Kunden und prüft die Qualität. Das
Produkt wird auf Trockeneis inkl. Qualitätskontrollbericht durch
Kurierservice ausgeliefert) • Mehrstufiges eigenes Chromatographieverfahren • Qualität: LPS-Endotoxin-, RNA-, DNA-, Protein- Entfernung
und Prüfung
Transfektionen, Virus-Produktion und VLP, siRNA, Referenzplasmide in
Kits, DNA-Vakzine und Gentherapie-Forschung
Plasmid-DNA für Forschung, Entwicklung, Prä-Klinik; Kultivierung Tierfrei und ohne Antibiotika; CGE-Analyse der Plasmid-Topologie; Entfernung
von LPS-Endotoxinen, DNA, RNA, Proteinen
Research Grade Plasmid DNA Production Service
PlasmidFactory GmbH & Co. KG
Meisenstr. 96
D-33607 Bielefeld
Tel.: +49-(0)-521-2997350,
eMail: nfo@plasmidfactory.com
www.plasmidfactory.com
Ansprechpartner: Dr. Martin Schleef
LABORWELT
LW3_04_(18,20-24)_tg.okokok
Wizard MagneSil PCR Clean-Up System
Aufreinigung von PCR-Fragmenten im 96-well-Format
Wizard SV 96 Genomic DNA Purification System
Aufreinigung genomischer DNA aus Gewebe,
Zellkultur und Pflanzenmaterial im 96-well-Format
2. Produktname
23
System für die Aufreinigung von PCR-Fragmenten im
96- und 384-well-Format, Fragmente zwischen 150 bp
und 23 kb werden mit hoher Ausbeute und Reinheit
aufgereinigt.
für gängige Liquidhandling-Plattformen geeignet
96- und 384-well-Format
vakuumbasiertes Bind - Wash - Elute-System für die
Aufreinigung von genomischer DNA im 96 well
Format. DNA ist für alle gängigen Applikationen
geeignet.
geeignet für alle gängigen Automationsplattformen,
entsprechende Scripte sind online verfügbar.
96-well-Mikrotiterplattensystem
8.1 Probengefäße
LABORWELT
16.06.2004, 16:06 Uhr
191,- g 1x96 preps, Großmengen auf Anfrage
9. Service/Anzahl Servicetechniker Deutschland? Zentrale in Mannheim
8.4 Steuerung
350,- g 4 x 96 preps, Großmengen auf Anfrage
Zentrale in Mannheim
30 min per 96 well plate, full walk away system
96 well / ca. 600 Isolationen von genomischer DNA
5. Arbeitsprinzip
8.2 Ortsauflösung
geeignet für manuelle und automatisierte Aufreinigung vollautomatisierte Aufreingung von PCR-Fragmenten
genomischer DNA im 96-well-Format
Bindung der DNA an Silica-Membran, Waschschritte
Bindung von DNA an MagneSil (paramagnetische
durch Zentrifugation oder Vakuum, Niedrigsalzelution Partikel), Niedrigsalzelution, magnetische Aufreinigung,
keine Vakuum- bzw. Zentrifugationsschritte notwendig
4. Einsatzgebiet
Promega GmbH
Schildkrötstraße 15
D-68199 Mannheim
Tel.: +49 (0)-621-8501-0
Fax: +49 (0)-621-8501-222
eMail: de_techserv@de.promega.com
www.promega.com
Promega GmbH
Schildkrötstraße 15
D-68199 Mannheim
Tel.: +49 (0)-621-8501-0
Fax: +49 (0)-621-8501-222
eMail: de_techserv@de.promega.com
www.promega.com
Steuerung: Input und Output erfolgt durch CSVformatierte Dateien
Einsatzmöglichkeiten: Nukleinsäure-Aufreinigung •
Klein und handlich, nur 30 cm breit und ohne
angegliederten PC, dadurch in jedem Labor einsetzbar
Technischer Service für anwendungsbezogene Fragen
(10 Personen)/ Feldservicetechniker für Geräte (6
Personen)
28.000,– g
Liquid-Handling erfolgt über 6 Kanäle (1/Probe), mit
jeweils 1 Spitze (1/Probe) • Nur Y- und Z-AchsenBewegung (keine X-Achsen-Bewegung), dadurch Schutz
vor Kreuzkontamination
System zur vollautomatisierten Aufreinigung von
Nukleinsäuren (DNA von Blut und Gewebe, RNA von
Zellen und Gewebe, gDNA von Bakterien und viele
weitere Probentypen) anhand von MagnetpartikelTechnologie
1-6 Proben/Run, in 1,5- bzw. 2 ml-Proben- und
Elutionsgefäßen. Reagenzien werden in vorgefüllten
Reaktionskartuschen geliefert.
• Aufreinigung von qualitativ hochwertigen
Nukleinsäuren von klinisch relevanten Probentypen, z.B.
Blut • 1-6 Proben werden innerhalb von
15-20 Minuten verarbeitet. Magnetpartikel-Technologie
ermöglicht sehr schnelle Aufreinigung in einem Schritt.
Dabei wird die Nukleinsäure im Lysat an die SilicaOberfläche der Magnetpartikel gebunden • Lieferung
aller Reagenzien in vorgefüllten EZ1-ReaktionsKartuschen, dadurch schnelles und einfaches Beladen
des Gerätes • Protokolle werden auf
vorprogrammierten EZ1-Protokollkarten geliefert. Sie
liefern die auf dem Bildschirm erscheinenden
Benutzerbefehle und Bedienungsbefehle des Gerätes. •
Die Anzahl an Kits und Protokollen für das BioRobot
EZ1- System wird ständig erweitert.
Niedriger bis mittlerer Durchsatz/ bis zu 50 Proben am
Tag
EZ1 RNA Tissue Mini Kit • Automatisierte Aufreinigung
qualitativ hochwertiger Gesamt-RNA aus bis zu 10 mg
Gewebe auf dem BioRobot EZ1-System • Schnelle
Aufreinigung von bis zu 30µg Gesamt-RNA aus einer
Vielzahl von Gewebetypen • Einsatzbereiche der
aufgereinigten DNA: u.a. Genexpressionsanalysen
anhand von Real-Time RT-PCR und MicroarrayTechnologien; Krebsforschung
• Schnelle, automatisierte Niedrig-DurchsatzNukleinsäure-Aufreinigung einer Vielzahl klinisch
relevanter Probentypen. • Minimale Benutzerinteraktion • Flexibel und vielseitig, für alle
verschiedenen Labortypen
Genexpressions-Analysen und klinische Forschung
BioRobot EZ1 Workstation und EZ1 Kits
QIAGEN GmbH
Qiagen-Straße 1
D-40724 Hilden
Ansprechpartnerin: Barbara Sürth
Tel.: +49-(0)-2103-29-12400, Fax: +49 (0)1033-29-22000,
eMail: techservice-de@qiagen.com
Technischer Service für anwendungsbezogene Fragen
(15 Personen)/ Feldservicetechniker für Geräte (10
Personen)
70.000,– g
• Liquid-Handling erfolgt über 6 gleichzeitig
arbeitende Kanäle, die die Aufnahme und Abgabe
kleiner Flüssigkeitsmengen (25-1000 µl) durch
Einwegpipettenspitzen mit Filter (1-3/Probe)
ermöglichen. • Schutz vor Kreuzkontamination durch
Einsatz unter Pipettenspitzen bei Bewegung •
Oberflächendekontamination zwischen den Läufen
durch UV-Licht.
Steuerung: Input und Output erfolgt durch CSVformatierte Dateien
Einsatzmöglichkeiten: Nukleinsäure-Aufreinigung
Mittlerer bis hoher Durchsatz/ von 48-120 Proben am
Tag
MagAttract Virus Mini M48 Kit: Zur Aufreinigung von
Nukleinsäuren aus verschiedenen DNA- und RNAViren aus Serum und Plasma für die hochsensitive
Detektion in Downstream-Applikationen • Parallele
Aufreinigung von 6-48 Proben auf dem BioRobot M48System ohne nachweisbare Kreuzkontamination •
Sensible Detektion einer Vielzahl von DNA-und RNAViren. Lineare Nukleinsäure-Ausbeuten erlauben
genaue quantitative Analysen für niedrige und hohe
virale Titer.
System zur vollautomatisierten Aufreinigung von
Nukleinsäuren anhand von MagnetpartikelTechnologie mit einer Vielzahl von spezialisierten
Applikationen (DNA/RNA-Aufreinigung, virale und
bakterielle gDNA)
6-48 Proben/Run, in 1,5- bzw. 2 ml-Proben- und
Elutionsgefäßen. Reagenzienvolumina werden
automatisch anhand der Probenanzahl berechnet.
• Vollautomatisierte Nukleinsäure-Aufreinigung einer
Vielzahl klinischer Proben, von 6-48 Proben per Run
(in Vielfachen von 6) • Standardisierte Bearbeitung
und erprobte MagAttract-Magnetpartikel-Technologie
für gleichmäßige Ausbeuten und verläßliche
Ergebnisse • Pipettenspitze wirkt als Reaktionsgefäß
und erhöht dadurch die Effizienz der
Magnetseparation • Das BioRobot m48-System wird
mit gebrauchsfertigen MagAttract-Protokollen
geliefert, die eine minimale Benutzerinteraktion
benötigen.
Genexpressions-Analysen und klinische Forschung
Vollautomatische Nukleinsäureaufreinigung einer
Vielzahl klinischer Proben. Die qualitativ hochwertigen
Nukleinsäuren sind fertig für den direkten Gebrauch
in sensiblen Downstream-Applikationen.
BioRobot M48 Workstation und M48 Kits
QIAGEN GmbH
Qiagen-Straße 1
D-40724 Hilden
Ansprechpartnerin: Barbara Sürth
Tel.: +49 (0)2103-29-12400, Fax: +49 (0)1033-29-22000,
eMail: techservice-de@qiagen.com
DNA-AUFREINIGUNG
| 23
LW3_04_(18,20-24)_tg.okokok
24
Präparationsdauer ca. 30 Minuten. Bei Verwendung
eines Vacuum-Manifolds können bis zu 24 Midi- oder
12 Maxi-Preps gleichzeitig aufgearbeitet werden.
Ausbeute: bis zu 350 µg (Midi) und 1,2 mg (Maxi)
hochreiner Plasmid-DNA • Weniger Reaktionsschritte
und dadurch weniger Plastikabfall als bei vergleichbaren HighSpeed-Kits anderer Hersteller • Keine
Phenol/Chloroform-Extraktion oder Alkohol • Präzipitation notwendig • Hohe Kosteneffizienz
24 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
16.06.2004, 16:06 Uhr
8.4 Steuerung
8.2 Ortsauflösung
8.1 Probengefäße
RTN10 GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit 10
Preps 27,50 g • auch 350 preps lieferbar
12 bis 18 Präparationen in 30 Minuten
Reinigung der Gesamt-RNA aus bis zu107 Zellen oder 40 DNA/gesamt u. mRNA/etc. aus Vollblut, Gewebe, Liquor,
mg Gewebe pro Präparation • Ausbeute: bis zu 150 µg
Stuhl, forensichen Proben, Lebens- u. Futtermitteln,
hochreine RNA pro Präparation
Pflanzen, Wattetupfern, paraffiniertes Material,
Bakterien, Gelen, PCR etc. • Virale DNA u. RNA simultan
aus Serum, Plasma, Tupfern, weiteren zellfreien
Körperflüssigkeiten, Bioptaten
Vertikal beweglicher Kopf mit Permanentmagneten und
Tip Halter, Permanentmagnet und Halter sind unabhängig gegeneinander beweglich. Die horizontale
Plattenzuführung erfolgt über einen Drehteller • Das
Gerät wird direkt mit den vorbefüllten Platten (Mikrotiter-, DW- und PCR-Platten) beladen. Dieser Vorgang
kann sowohl manuell als auch über einen Roboterarm
erfolgen. Es erfolgt ein serielles Abarbeiten der Schritte
Binden, Waschen, Eluieren von Platte zu Platte • Das
Gerät ist vollautomatisier- und integrierbar, eine
Softwarekomponente hierfür ist im Lieferumfang
enthalten • Bedingt durch die Einfachheit des Gerätes,
ist keine Schulung für dessen Bedienung erforderlich.
Eine benutzerfreundliche Software (im Lieferumfang)
ermöglicht es selbständig eigene Programme zu
erstellen
Ausgangsmaterial in Guanidinthiocyanat lysieren und
homogenisieren, um RNA und inaktive RNAsen zu
entfernen, Lysat über Filtrationssäule reinigen
(Entfernung von Zellbestandteilen etc.), Filtrat auf
Silicasäule mit hoher RNA-Bindungskapazität aufgeben,
dann Waschschritt und Elution der gebundenen RNA
Zentrifugierte Zellen werden einer modifizierten
alkalischen SDS-Lyse unterzogen, das Lysat wird in
einer Filterspritze neutralisiert und die DNA an eine
Silica-Membran gebunden. Kontaminationen werden
mittels Waschschritt entfernt. Anschließend erfolgt die
Elution der gebundenen DNA.
5. Arbeitsprinzip
1NA0200 GenElute HP Plasmid Midiprep Kit 25 Preps:
146,50 g • NA0310 GenElute HP Plasmid Maxiprep Kit
25 Preps: 328,30 • Mega- und Giga-Kits demnächst
Vertikal und horizontal beweglicher Kopf mit
Permanentmagneten und Tip-Halter, Permanentmagnet und Halter sind unabhängig gegeneinander
beweglich. Das Gerät wird direkt mit den vorbefüllten
5-Well-Streifen beladen. Es erfolgt eine serielle
Abarbeitung der Schritte Binden, Waschen, Eluieren
von Well zu Well • Bedingt durch die Einfachheit des
Gerätes, ist keine Schulung für dessen Bedienung
erforderlich. Eine benutzerfreundliche Software (im
Lieferumfang) ermöglicht es selbständig eigene
Programme zu erstellen
Das Grundprinzip des Gerätes beruht auf der
Analytenbindung, dem Waschen der Beads und der
Elution des Analyten in verschiedenen Wells von 96Well-Platten • Das Rühren der Probe erfolgt durch die
Vertikalbewegung einer Einweg-Kunstoffspitze (Tip).
Durch Eintauchen des Permanentmagneten in den Tip
werden die Beads an Außenseite des Tip reversibel
immobilisiert. Es erfolgt eine Übertragung der Beads in
das nächste Well mit anschließender Freisetzung der
Beads durch Herausfahren des Permanentmagneten
aus dem Tip
Aufreinigung von Plasmid-DNA z.B. für TransfekGereinigte RNA geeignet für RT-PCR, Northern Blots,
tionen, Restriktionsverdau, Ligation und automatischer Microarrayanalysen
Sequenzierung
4. Einsatzgebiet
DNA/gesamt u. mRNA/etc. aus Vollblut, Gewebe,
Liquor, Stuhl, forensichen Proben, Lebens- u.
Futtermitteln, Pflanzen, Wattetupfern, paraffiniertes
Material, Bakterien, Gelen, PCR etc. • Virale DNA u.
RNA simultan aus Serum, Plasma, Tupfern, weiteren
zellfreien Körperflüssigkeiten, Bioptaten
Aufreinigung von DNA, RNA (Proteinen, Zellen) aus
verschiedensten Quellen
Isolierung von Gesamt-RNA aus Säugerzellen- und
-geweben
Die GenElute HP Plasmid Midiprep und Maxiprep-Kits
ermöglichen die Aufreinigung hochreiner PlasmidDNA in weniger als 30 Minuten.
33.400 g
12
1-1.500 Proben (bis zu 96 Proben simultan)
Gerät zur Automatisierung von kommerziellen Kits oder
selbsterstellten Arbeitsabläufen mit magnetischen
Beads. Als Stand-alone-Version oder integriert nutzbar
12.120 g
12
1-240 Proben (bis zu 15 Proben simultan)
Das Grundprinzip des Gerätes beruht auf der
Analytenbindung, dem Waschen der Beads und der
Elution des Analyten in verschiedenen Wells eines 5Well-Streifens • Das Rühren der Probe erfolgt durch
die Vertikalbewegung einer Einweg-Kunstoffspitze
(Tip). Durch Eintauchen des Permanentmagneten in
den Tip werden die Beads an Außenseite des Tip
reversibel immobilisiert. Es erfolgt eine Übertragung
der Beads in das nächste Well mit anschließender
Freisetzung der Beads durch Herausfahren des
Permanentmagneten aus dem Tip.
Aufreinigung von DNA, RNA (Proteinen, Zellen) aus
verschiedensten Quellen
Gerät zur Automatisierung von kommerziellen Kits
oder selbsterstellten Arbeitsabläufen mit
magnetischen Beads. Stand-alone-Gerät
KingFisher mL
KingFisher 96
GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit
GenElute High Performance (HP) Plasmid Midi- oder
Maxi-Kits
Thermo Electron Corp.
Im Steingrund 4-6
D-63303 Dreieich
Ansprechpartner: Ulf Magnus Wolkersdorfer
Tel.: 0172-9818862
2. Produktname
Thermo Electron Corp.
Im Steingrund 4-6
D-63303 Dreieich
Ansprechpartner: Ulf Magnus Wolkersdorfer
Tel.: 0172-9818862
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Eschenstraße 5
D-82024 Taufkirchen
www.sigma-aldrich.com
Dr. Margit Stadler
eMail: mstadler@europe.sial.com
Tel: 089/6513-1509 Fax: 089/6513-1399
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Eschenstraße 5
D-82024 Taufkirchen
www.sigma-aldrich.com
Dr. Margit Stadler
eMail: mstadler@europe.sial.com
Tel: 089/6513-1509 Fax: 089/6513-1399
LABORWELT
B L I T Z L I C H T
DNA-Aufreinigung
왔
A
Tangentialflußfiltration (TFF)
zur Aufkonzentrierung und
Umpufferung linearer DNA
Dr. Margarete Hannappel, Millipore GmbH, Schwalbach am Taunus
Florian Sack, Mologen AG, Berlin
Die Ultrafiltration im Tangentialflußmodus ist in industriellen Prozessen ein anerkanntes Verfahren zur Separation biologischer Substanzen. Im Labormaßstab wurde untersucht, inwieweit sich diese Technik zur Aufkonzentrierung und Umpufferung linearer, doppelsträngiger DNA eignet. Membranen mit unterschiedlichen Ausschlußgrenzen (5 kD, 10 kD, 30
kD) wurden zunächst auf die Rückhaltung linearisierter Plasmide (1.600, 1.800 oder 2.100
Basenpaare) überprüft. Eine vollständige Retention wurde nur bei der 5 kD-Ultracel® PLCMembran festgestellt. Die Aufkonzentrierung verdünnter Lösungen bis zu einer DNA-Konzentration von 2 mg/ml war mittels Tangentialflußfiltration möglich, wobei der Prozeßverlauf
durch die Wahl der Membran beeinflußt wurde. Insgesamt erwies sich die TFF als ein Verfahren zur Konzentrierung und Diafiltration linearer DNA in Lösung, das sich im Volumenbereich zwischen 100 ml und 1.000 ml einsetzen läßt.
Key Words: lineare DNA, DNA-Aufkonzentrierung, DNA-Umpufferung, Tangentialflußfiltration, TFF, Ultrafiltration
Lineare, doppelsträngige DNA-Moleküle (linearisierte Plasmide, Vektoren) sind wichtige Zwischen- oder Endprodukte bei der Entwicklung und Produktion von DNA-Arzneimittelkandidaten (zum Beispiel bei der Gen-
therapie oder DNA-Vakzinierung). Innerhalb
des Entwicklungs- und Herstellungsprozesses müssen diese häufig aufkonzentriert oder
in andere Puffer transferiert werden. Dabei
können die im Labormaßstab üblichen Me-
B
Abb. 2: Aufbau und Durchführung von
TFF-Versuchen. A. Membrankassette in einem
TFF-Komplettsystem (Labscale™-TFF-System,
Millipore)
B. Membrankassette mit Einzelkomponenten zu
einem TFF-System zusammengestellt. Betriebsvolumen in Abhängigkeit vom System 25 ml bis
1.000 ml
thoden wie Ethanolfällung oder Dialyse selten angewendet werden, weil die Lösungsansätze vergrößert oder die Verfahren für einen späteren Produktionsprozeß unter GMPBedingungen ungeeignet sind. In der biopharmazeutischen Industrie ist die Ultrafiltration im Tangentialflußmodus eine verbreitete Methode zur Abtrennung und Aufkonzentrierung biologischer Stoffe. In diesem Zusammenhang wurde die Anwendung dieser
Aufreinigungs-Technik zur Konzentrierung
und Diafiltration von linearer, doppelsträngiger DNA in Lösung untersucht und für Volumina bis 1.000 ml getestet.
Ultrafiltration im Tangentialflußmodus
Abb. 1: Prinzip der Tangentialflußfiltration. Die Membranfläche wird tangential von der Produktlösung
überströmt. In Abhängigkeit vom angelegten Transmembrandruck (TMP: „Trans Membrane Pressure“)
wird ein Teil der Flüssigkeit durch die Membran auf die Filtratseite gepreßt. Moleküle, die aufgrund
ihrer Größe die Membranporen nicht passieren können, werden auf der Retentatseite zurückgehalten.
(P: Druck, ∆P: Differenzdruck)
Die Ultrafiltration trennt gelöste Moleküle
nach Molekülgröße aus Flüssigkeiten über
eine Membran. Ultrafiltrationsmembranen
werden gewöhnlich im Tangentialflußmodus
eingesetzt (Abb. 1).
Ultrafiltrationsmembranen werden von
den Herstellern nach ihrer Ausschlußgrenze
(nominelle Molekulargewichtsgrenze oder
„Cut-off“) klassifiziert und zur Trennung
oder Anreicherung von Stoffen zwischen
1.000 bis 1.000.000 Dalton eingesetzt. Für die
Zurückhaltung globulärer Proteine wird in
LABORWELT
LW3_04_(25-27)_tg.okokok
25
16.06.2004, 16:13 Uhr
| 25
B L I T Z L I C H T
A
B
PLC 5kD, keine DNA im Filtrat nachgewiesen. Bei allen anderen Membranen wurde
während des gesamten TFF-Prozesses ein
kontinuierlicher Strom an DNA in das Filtrat
festgestellt. Die Stärke des DNA-Flusses wurde mit steigender Ausschlußgrenze größer
und konnte zusätzlich durch Veränderungen
des Transmembran- und Differenzdruckes
gesteigert oder reduziert werden.
Aufkonzentrierung
linearer DNA mittels TFF
Abb. 3: Vergleich der DNA vor und nach der TFF-Durchführung. Lineare DNA-Fragmente in Lösung
wurden mittels TFF von 0,2 mg/ml auf 2 mg/ml aufkonzentriert. Für diese Anwendung wurden die
Membranen Ultracel® PLC 5 kD (A) und Ultracel® PLC10 kD (B) getestet. Die DNA-Proben wurden in
einem 1%igen Agarose-Gel analysiert (DNA-Proben: 1.600/1.800 Bp (A), 1.600/2.100 Bp (B).
Bahn 1: DNA-Marker (Gene Ruler™, Fermentas), Bahn 2: DNA vor der Aufkonzentrierung mittels TFF,
Bahn 3: DNA nach der Aufkonzentrierung mittels TFF. (Bp: Basenpaare)
der Regel eine Membran mit einer 3- bis 5fach
kleineren Ausschlußgrenze als dem Molekulargewicht des Produktes gewählt.
DNA-Moleküle mit rund 2.000 Basenpaaren besitzen ein Molekulargewicht im Bereich
von 1,2 x 106 Dalton. In linearer Form handelt es sich um dünne Molekülfäden mit einer Länge von ungefähr 680 nm und einem
Durchmesser von 2 nm. Bei welchen Ausschlußgrenzen diese Moleküle im Retentat
zurückgehalten werden, mußte zunächst ermittelt werden. Dazu wurden Membranen
mit unterschiedlichen Porengrößen hinsichtlich ihrer Durchlässigkeit gegenüber linearer
DNA getestet. Die verwendeten Testlösungen
enthielten jeweils zu gleichen Teilen zwei lineare DNA-Fragmente (1.600/1.800 Basenpaare oder 1.600/2.100 Basenpaare), die
durch Spaltung eines Plasmids erhalten wur-
den. Die Testfragmente lagen in Puffer (20
mM Tris/HCl pH 7,4, 900 mM NaCl) mit einer Gesamtkonzentration von 0,2 mg/ml vor.
Zur Überprüfung der DNA-Qualität und
zum Nachweis eines DNA-Flusses durch die
Membran in das Filtrat wurden Retentat und
Filtratfraktionen gelelektrophoretisch analysiert.
Für die Versuche wurden Kassettenmodule mit einer Membranfläche von 50 cm2 (Pellicon® XL-Kassetten, Millipore) gewählt. Sie
wurden zur Durchführung der TFF in ein
Komplettsystem eingesetzt oder mit Einzelkomponenten zu einem TFF-System zusammengeschlossen (Abb. 2).
Von den getesteten Ultrafiltrationsmembranen1 (5 kD-Biomax®-Membran, 5 kD, 10
kD und 30 kD Ultracel® PLC-Membranen)
wurde bei einer einzigen Membran, Ultracel®
Abb. 4: Filtratfluß in Abhängigkeit von der Konzentration. Der Filtratfluß wurde während der Aufkonzentrierung gemessen. Die Ausgangskonzentration war 0,2 mg/ml.
Nach der Membranevaluierung wurde der
Aufkonzentrierungsprozeß bis zu einer finalen DNA-Konzentration von 2 mg/ml näher
charakterisiert. Dazu wurden vergleichende
TFF-Versuche mit den Membranen Ultracel®
PLC 5 kD und Ultracel® PLC 10 kD durchgeführt. Bei Verwendung der 10 kD-Ultracel®
PLC-Membran war in den Vorversuchen ein
DNA-Fluß durch die Membran festgestellt
worden. Dieser lag in Relation zum Gesamtprodukt weit unter 1%.
Durch Anwendung der TFF konnte die
DNA mit beiden Membranen problemlos von
0,2 mg/ml auf 2 mg/ml aufkonzentriert werden. Die DNA selbst wurde durch den TFFProzeß in ihrer Qualität und Zusammensetzung nicht verändert. Im Agarose-Gel war
kein Unterschied zwischen der Ausgangslösung und der konzentrierten Probe zu erkennen (Abb. 3).
Ein weiterer wichtiger Prozeßparameter ist
der Filtratfluß. Er wurde während der Konzentrierungsphase in bestimmten Abständen
gemessen. Um eine Veränderung in Abhängigkeit von der steigenden Produktkonzentration aufzuzeigen, wurden die ermittelten Filtratflüsse gegen den Konzentrationsfaktor
(VCF: „Volumetric Concentration Factor“) in
einem Diagramm graphisch dargestellt (Abb.
4). Hierbei wurde ein unterschiedliches Verhalten zwischen den Membranen Ultracel®
PLC 5 kD und Ultracel® PLC 10 kD sichtbar.
Im Falle der 10 kD-Membran nahm der Filtratfluß vom Beginn bis zum Ende der Konzentrierungsphase ab. Insgesamt wurde der
Filtratfluß um rund 30% reduziert. Bei Einsatz
der 5 kD-Membran blieb dagegen der Filtratfluß bis zu einer DNA-Konzentration von ungefähr 1 mg/ml (VCF=5) stabil und sank erst
danach ab. Werden die Daten aus anderen
Aufkonzentrierungsversuchen hinzugezogen,
so ist bei der 30 kD-Membran ebenfalls über
den gesamten Prozeß eine abnehmende Tendenz des Filtratflusses zu erkennen. Bei der 5
kD-Ultracel® PLC-Membran wurde der anfängliche, konstante Filtratfluß bei niedrigen
und hohen Druckeinstellungen beobachtet.
Der Verlauf des Filtratflusses bei den Membranen Ultracel® PLC 10 kD und 30 kD deutet
auf eine allmähliche Verblockung der Membran hin. Möglicherweise verfangen sich die
langen Molekülfäden bei der Membranpassage in den Durchgängen, bleiben hängen und
verstopfen diese allmählich. Bei der 5 kD-UlLABORWELT
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B L I T Z L I C H T
왘
tracel® PLC-Membran können die DNA-Moleküle scheinbar nicht in
die Membranporen eindringen. Die Reduzierung des Filtratflusses nach
einer konstanten Anfangsphase ist hier höchstwahrscheinlich auf Polarisationseffekte zurückzuführen. Dies bedeutet, daß der Filtratfluß
durch erhöhte Produktkonzentration an der Membranoberfläche behindert wird. Unterstützt werden diese Annahmen durch Ergebnisse
aus Fouling-Tests und Daten zur Membranreinigung. Ein Maß für den
Reinigungsgrad einer Membran stellt das Erreichen der ursprünglichen Permeabilität für reines Wasser dar. Dieser als NWP<2 („Normalized Water Permeability“) bezeichnete Wert konnte bei Ultracel® PLC
5 kD zu 97 bis 99% wiederhergestellt werden. Bei anderen Membranen
wurden dagegen unter den gleichen Reinigungsbedingungen 69% (Ultracel® PLC 10 kD) und 34% (Ultracel® PLC 30 kD) des ursprünglichen
NWPs erreicht. Offensichtlich sind einmal in der Membran gefangene
DNA-Moleküle nur durch stärkere Reinigungsverfahren wieder zu entfernen.
Neben den Versuchen zur Aufkonzentrierung wurden unter Anwendung der Membran Ultracel® PLC 5 kD auch Versuche zur Diafiltration erfolgreich durchgeführt. So wurde zur Entfernung des hohen Salzgehaltes (900 mM NaCl) die Lösung sukzessive mit dem achtfachen
Volumen an Wasser diafiltriert. Auch im Verlaufe dieses Prozesses
wurde keine DNA-Passage festgestellt.
Fazit
Aufbauend auf den vorliegenden Ergebnissen kann die TFF als eine
geeignete Methode zur Aufkonzentrierung und Umpufferung linearer, doppelsträngiger DNA in Lösung betrachtet werden. Bei Wahl
entsprechender Module ist diese Technik auch im Laborbereich für
Volumina zwischen 100 ml bis 1.000 ml erfolgreich einsetzbar und
kann für spätere Volumenvergrößerungen linear angepaßt werden
(Pellicon XL- und Pellicon 2-Kassetten). Umpufferungen sind direkt
im Anschluß an Aufkonzentrierungsschritte im gleichen System
durchführbar. In Abhängigkeit von der Membran und dem eingesetzten TFF-System konnten hier Produktausbeuten von 90 bis 100%
erzielt werden.
Die 5 kD-Ultracel® PLC-Membran gewährleistet stabile und reproduzierbare Prozeßbedingungen. Es handelt sich hierbei um eine Kompositmembran auf Zellulosebasis. Ein DNA-Fluß durch die Membran
konnte sowohl bei hohen als auch niedrigen Salzkonzentrationen in
den Untersuchungen nicht beobachtet werden. Lineare DNA wurde
vollständig im Retentat zurückgehalten. Bei der Wahl höherer Ausschlußgrenzen sind auftretende DNA-Flüsse durch die Membran
möglicherweise im Gesamtprozeß hinsichtlich des Produktverlustes
zu vernachlässigen. Jedoch begünstigen sie die Verblockung und erschweren die Reinigung der Membran. Bei der Membran Ultracel®
PLC 5 kD wurden solche Effekte nicht beobachtet.
Literatur
[1]
[2]
Millipore, Lit.No. PF1401EN
Michaels S.L., Biopharm 7 (1994), 38-45
Korrespondenzadressen
Dr. Margarete Hannappel
Millipore GmbH
Am Kronberger Hang 5, D-65824 Schwalbach
Tel.: +49-(0)6196-494-0
eMail: Margarete_Hannappel@Millipore.com
Dipl.-Ing. Florian Sack
Mologen AG
Fabeckstr.30, D-14195 Berlin
eMail: sack@mologen.com
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27
16.06.2004, 16:18 Uhr
| 27
B L I T Z L I C H T
real-Time PCR
ter (CQR) Malariastämme ist von großer Bedeutung. Hier ergaben sich durch die Klärung
der funktionellen Rolle des PfCRT-Proteins mit
der in allen untersuchten CQR-Stämmen von
P. falciparum gefundenen K76T-Mutation neue
diagnostische Möglichkeiten4. Außerdem erwiesen sich die Sequenz des pfcrt-Gens und
die der CQR zugrundeliegenden Mechanismen als artspezifisch für P. falciparum5. Danach
왔
RT-PCR-Resistenznachweis
in der Malariadiagnostik
Nicole Kasdepke und Rainer Söller, artus GmbH, Hamburg
Ein spezifischer und sensitiver Schnelltest zum kombinierten Nachweis von Plasmodium falciparum und einer möglichen Resistenz gegen Chloroquin wird vorgestellt. Der Test weist mit
Hilfe der real-time PCR das pfcrt-Gen von P. falciparum sowie in einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse dessen K76T-Punktmutation als Ursache der Chloroquin-Resistenz nach. Chloroquin-resistente und -sensitive Stämme von P. falciparum zeigen gut unterscheidbare Schmelzkurven, die auch in Doppelinfektionen erkannt werden. In einer laufenden Untersuchung an
klinischen Proben importierter Malaria zeigte die PCR-Methode 100% Übereinstimmung mit der
Artbestimmung nach Routinediagnostik. Die Vorteile der real-time PCR liegen in einer sicheren
Bestimmung von P. falciparum – auch in Fällen von Doppelinfektionen mit einer zweiten Malaria-Art oder bei niedriger Parasitämie von P. falciparum in der frühen Infektionsphase. Der Test
bietet somit eine schnelle und sichere Diagnostik von P. falciparum und ein Monitoring möglicher Chloroquin-Resistenzen in einem Ansatz.
Key Words: Malaria tropica, Plasmodium falciparum, real-time PCR, Chloroquin-Resistenz
In der Routinediagnostik der Malaria ist die
Mikroskopie weltweit immer noch der “GoldStandard”. Allerdings stößt diese klassische
Analysemethode an ihre Grenzen, wenn qualifiziertes Personal fehlt und viele Blutproben
mit potentiell niedriger Parasitämie zu analysieren sind. Dabei sind Blutproben mit niedriger Parasitämie grundsätzlich ein Problem, da
die durchschnittliche Sensitivitätsgrenze der
meisten Routinelabore nur zwischen 50 und
500 Parasiten/µl beim “dicken Tropfen” liegt,
im Blutausstrich sogar nur bei 5000 Parasiten/
µl1. Zusätzlich kann die Sicherheit der mikroskopischen Analyse von Faktoren wie persönlicher Erfahrung des Personals, dem Vorhandensein möglicher Doppel- oder MehrfachInfektionen verschiedener Plasmodium-Arten
sowie dem Fehlen eindeutiger Entwicklungsstadien relativ stark beeinträchtigt werden.
Hier bieten „Rapid Diagnostic-Tests“, die
auf immunologischen oder molekularbiologischen Techniken basieren, Alternativen zur
klassischen Malariadiagnostik1. Hinsichtlich
einer verbesserten Sensitivität und Spezifität
erreichen einige PCR-Tests Nachweisgrenzen
von weniger als 5 Parasiten/µl Blut bei einer
Spezifität von nahezu 100%2. Auch das erste
kommerzielle real-time PCR-Testkit zum generellen Screening von Malariaparasiten, das
RealArt® Malaria LC PCR Kit der Firma artus,
zeigte eine gute Routinetauglichkeit in einer
unabhängigen Studie3. Das Kit ist inzwischen
entsprechend der EU-Richtlinie für die in-vitro- Diagnostik (IVD) von EDTA-Vollblut CEzertifiziert.
Eine umfassende Malariadiagnostik erfaßt
auch existierende Chemoresistenzen. Insbesondere die Ausbreitung Chloroquin-resisten-
Abb. 2: Partielles Alignment von DNA-Sequenzen der K76T-Region des pfcrt-Gens von P. falciparum
(Codons 71-81 des PfCRT-Proteins). Das für CQR oder CQS verantwortliche Codon 76 ist eingerahmt und
die entscheidende Transversion A/C fett markiert. Nr. 1 und 3-7 wurden durch Sequenzierung der CQPCR-Produkte aus klinischen Blutproben gewonnen. Die Sequenzen Nr. 1-5 sind aus [5]* bekannt, Nr. 2
wurde in dieser Studie noch nicht gefunden und das PCR-Produkt zu Kontrollzwecken daher synthetisch hergestellt (Geneart, Regensburg). Punkte im Alignment bedeuten dasselbe Nukleotid wie in Nr.
1, abweichende Basenpositionen sind im IUPAC Code angegeben. Unter [MT] und [TM] sind die
Schmelzkurven-Typen (R=CQR, S=CQS) und die experimentell bestimmten Schmelzpunkte in °C angegeben (siehe Abb. 3). * Genbank-Nummern af468006, af233065, af233067, af233064, af233066.
Abb. 1: Orientierung und Funktion von Primern
und Sonden der CQ-real-time PCR aus [7] nach
dem Prinzip von [9]. Der intern mit LC640 markierte reverse Primer dient nach Verlängerung
während der PCR als Anker-Sonde. Die spezifische Anregung von LC640 erfolgt nach Hybridisierung der am 3’-Ende mit Fluorescein markierten Sensor-Sonde. Die Sensor-Sonde erlaubt
eine sehr sensitive Differentialdiagnostik der
CQR-Allele durch Schmelzkurvenanalyse im
LightCycler nach der PCR. Die relative Lage der
für die CQ-Resistenz verantwortlichen Transversion A/C ist eingezeichnet.
wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen
unterschiedliche PCR-Tests zum Nachweis der
K76T-Mutante in CQR-Stämmen von P. falciparum vorgestellt6-8.
Entwicklung
des real-time PCR-Systems
Die hier vorgestellte CQ-PCR ist eine Weiterentwicklung der real-time PCR von de Monbrison et al.7, wobei die relative Orientierung
und Fluoreszenzmarkierung von Primern und
Sonde beibehalten wurde (Abb. 1). Nur mit
dieser erstmals von Lay et al. 9 für den
LightCycler beschriebenen Variante von markierter Sensor-Sonde und dem in der PCR verlängerten markierten Primer als Anker-Sonde war in der A/T-reichen Zielsequenz um die
K76T-Mutation eine stabile real-time-PCR mit
Schmelzkurvenanalyse realisierbar. Obwohl
die PCR und Schmelzkurvenanalyse mit den
publizierten Sequenzen von Primern und Sonde prinzipiell funktionierte, wurden beide für
diese Studie im Hinblick auf eine sichere Differenzierung aller bisher bekannt gewordenen
Schmelzkurventypen weiter optimiert. Im
Rahmen der PCR-Entwicklung wurden zunächst die Sequenzen von Primern und Sonde aus [7] in einem Alignment mit den pfcrtSequenzdaten aus [4] verglichen. Dabei ergab
sich das Problem die für die CQR entscheidende Transversion „A/C” an der zweiten Position des K76T-Codons möglichst unabhängig
von weiteren, sich stromaufwärts anschließenden Punktmutationen nachzuweisen. Daher
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28
16.06.2004, 16:22 Uhr
B L I T Z L I C H T
wurden verschiedene Sequenzvarianten der
Sonde mit angepaßten Primern an klinischen
Proben importierter Malaria tropica aus der
Routinediagnostik des Bernhard-Nocht-Instituts für Tropenmedizin (Prof. Tannich, Hamburg) getestet und sequenziert, um ein möglichst klares Bild der auftretenden Sequenzvariationen in der K76T-Zielregion zu erhalten. Aus diesen Daten wurde dann ein routinetaugliches PCR-System zum differentiellen
Nachweis aller Allele der K76T-Zielregion
vorgeschlagen.
Funktionalität
des real-time PCR-Systems
Mit dem ausgewählten PCR-System ließen
sich alle bisher in klinischen Blutproben10 gefundenen Allele der CQR- und CQS-Stämme
von P. falciparum sicher unterscheiden (Abb.
3) und in unbekannten Proben selbst in Doppelinfektionen mit anderen Plasmodien-Arten
wieder erkennen. Im Rahmen dieser Studie
konnte bislang noch keine Probe mit dem
CQS-Allel „1S“, entsprechend Nr. 2 in Abbildung 2 und 3, gefunden werden. Daher dient
das ursprünglich zu Kontrollzwecken synthetisch hergestellte PCR-Produkt bis auf weiteres als Positivkontrolle in jedem PCR-Lauf.
Zur Bewertung der Ergebnisse einer CQreal-time-PCR und einer möglicherweise daraus abzuleitenden Therapie zählt nur, ob sich
nach der PCR eine Schmelzkurve mit einem
Schmelzpunkt in der Nachbarschaft (± 1° C)
einer der beiden CQR-Schmelzkurventypen
(1R, 2R) zeigt. Dies ist zur Bewertung der gelegentlich auftretenden Doppelinfektionen mit
mehr als einem CQ-Allel essentiell. In den
beiden Beispielen der nicht-eindeutigen
Schmelzkurven Nr. 6 und 7 in Abbildung 3 ist
dies der Schmelzpunkt des CQR-Schmelzkurventyps „2R”. In Zweifelsfällen ist immer von
der Anwesenheit eines CQR-Allels in niedriger Kopienzahl auszugehen – entsprechend
einer niedrigen Parasitämie der CQR-Malarialinie. Das bedeutet die Anwesenheit mindestens eines CQR-Allels in der Probe, was den
sinnvollen Einsatz von CQ als mögliches Antimalariamittel ausschließt.
Eine Bestätigung des resistenten Genotyps
durch DNA-Sequenzierung aus dem PCRProdukt, wie bei den Proben Nr. 6 und 7 durchgeführt, ist nur bei Proben mit noch gut sichtbaren Schmelzkurven möglich. In Fällen geringerer Kopienzahlen des CQR-Allels mit
sehr kleinen bis nur noch ansatzweise sichtbaren Schmelzkurven kann die DNA-Sequenzierung nicht erfolgen. In diesen Fällen wird
der „vorsorgliche Verzicht” auf den Einsatz
von CQ empfohlen.
Malaria-Artbestimmung
In allen Blutproben, die mit anderen Testsystemen, wie zum Beispiel dem generellen Malaria-PCR-Kit von artus, Malaria-positiv getestet wurden, kann mit dem Nachweis einer
Schmelzkurve in der CQ-real-time PCR auch
eine sichere Artbestimmung von P. falciparum
erfolgen. Zeigt eine Malaria-positive Blutpro-
PCR und Schmelzkurvenanalyse. Die restlichen fünf Proben zeigten in der CQ-PCR zwar
schwache, aber eindeutige Schmelzkurven. In
einer der Proben konnte bislang durch Sequenzierung des PCR-Produkts aus einer generellen Malaria-PCR eine Doppelinfektion von P.
vivax und P. falciparum erkannt und das Ergebnis der CQ-PCR nachträglich bestätigt werden.
Die Sequenzierung der anderen Proben steht
noch aus, kann aber wegen der schwachen
Parasitämie von P. falciparum und einer hohen
Parasitämie der anderen Plasmodium-Art
auch ergebnislos bleiben. In diesen Fällen wird
dann ebenso wie oben der “vorsorgliche Verzicht” auf den Einsatz von CQ empfohlen.
Zusammenfassung
Der vorgestellte real-time PCR-Test für den
LightCycler ist ein kombiniertes Nachweissystem für P. falciparum-Infektionen und CQR.
Er stellt eine Ergänzung zum Malaria-PCR-Kit
der Firma artus dar und wird in Kürze als
kommerzielles PCR-Kit unter dem Markennamen „RealArt® Malaria CQ Resistance LC PCR
Kit” vertrieben werden.
Literatur
[1]
[2]
Abb. 3: Schmelzkurvenanalyse nach einer CQreal-time PCR. Die Kurven 1-5 zeigen die
Schmelzkurventypen von CQR (1R, 2R) und CQS
(1S, 2S) Malariaproben, die Nummerierung entspricht den in Abb. 2 gezeigten Genotypen. Die
Schmelzkurven 6 und 7 entsprechen keinem eindeutigen Schmelzkurventyp und erwiesen sich
nach Sequenzierung der PCR-Produkte als Überlagerung der Kurven von 2R und 2S (Doppelinfektion aus CQR- und CQS-Stämmen von P. falciparum). Die Schmelzpunkte der „reinen“ Schmelzkurventypen sind durch die farbigen, senkrechten
Linien markiert und die Temperatur unten angegeben.
be nach der CQ-PCR keine Schmelzkurve,
kann eine P. falciparum-Infektion ausgeschlossen werden. So wurden bisher alle mikroskopisch als P. falciparum bestimmten Proben der
laufenden Studie10 durch eine Schmelzkurve
in der CQ-PCR bestätigt. Darüber hinaus ergaben sich in 40 von 45 mikroskopisch als Malaria-positiv bestimmten Proben von P. vivax,
P. malariae oder P. ovale kein Signal in der CQ-
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
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Dr. Rainer Söller
artus Gesellschaft für molekularbiologische
Diagnostik mbH
Königstraße 4a, D-22767 Hamburg
Tel.: 040-41364753, Fax: 040-41364710
eMail: soeller@artus-biotech.de
www.artus-biotech.de
왔
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16.06.2004, 16:23 Uhr
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20
together with the SBCF
8 th International World Congress of Cell Biology
NICE
France
4 - 8 September, 2004
Minisymposia
Endocytic routes
Harold Stenmark (Oslo)
Richard Pagano (Rochester)
Autophagy
Beth Levine (New York)
Patrice Codogno (Villejuif)
Signals in membrane traffic
Juan Bonifacino (Bethesda)
Blanche Schwappach (Heidelberg)
Signalling in development
Caroline Hill (London)
Danny Huylebroeck (Leuven)
Cell signalling
Susan Pierce (Bethesda)
Ivan Dikic (Frankfurt)
G protein signalling
Doron Lancet (Rehovot)
David Siderovski (Chapel Hill)
Biological networks
Naama Barkai (Rehovot)
Francois Nédéléc (Heidelberg)
Cellular oscillations
Albert Goldbeter (Brussels)
Ueli Schibler (Geneva)
Shaping life through apoptosis
Hermann Steller (New York)
Christine J. Watson (Cambridge, UK)
Mitosis
Frank Uhlman (London)
Maurizio Gatti (Rome)
Microtubule motors
Isabelle Vernos (Heidelberg)
Rob Cross (Oxted)
Cell cycle
Margarete Heck (Edinburgh)
Simonetta Piatti (Rome)
Actin
Joel Vandekerckhove (Gent)
Fulma Buss (Cambridge, UK)
Functional organization
of the cell nucleus
Karla Neugebauer (Dresden)
Tom Misteli (Bethesda)
Genome identity
Haig Kazazian (Philadelphia)
Thomas Cremer (Munich)
ELSO-Stand
31
RNA localization and control
Ralf Jansen (Munich)
Matthias Hentze (Heidelberg)
Stem cells and regeneration
Christine Mummery (Utrecht)
Emili Salo (Barcelona)
Evolutionary principles in cells and embryos
Denis Duboule (Geneva)
Vincent Laudet (Lyon)
Patterns of growth and form in plants and animals
Eric Thompson (Bergen)
R. Scott Poethig (Philadelphia)
Polarity in plants and animals
Frederic Berger (Lyon)
Thomas Lecuit (Marseille)
ECM and development
Leena Bruckner-Tuderman (Freiburg)
Bjorn Olsen (Boston)
Cell adhesion
Martin Humphries (Manchester)
Shoichiro Tsukita (Kyoto)
Cell biology of infectious diseases
Jean-Pierre Gorvel (Marseille)
Peter Rottier (Utrecht)
Neurogenesis
Barry Dickson (Vienna)
Nobukata Hirokawa (Tokyo)
Cell physiology and homeostasis
Martin Bootman (Babraham)
Tullio Pozzan (Padova)
Tissue repair
Paul Martin (London)
Sabine Werner (Zurich)
New technologies in cellular processes
Herman Gaub (Munich)
Daniel Mueller (Dresden)
Plenary Sessions
Rob Parton (Brisbane)
Judith Klumperman (Utrecht)
Aki Kusumi (Nagoya)
Axel Ullrich (Munich)
Helena Edlund (Umea)
Phil Cohen (Dundee)
Pernille Rorth (Heidelberg)
Laura Machesky (Birmingham)
Rong Li (Cambridge, USA)
Maria Carmo-Fonseca (Lisbon)
Geneviève Almouzni (Paris)
Titia de Lange (New York)
Mark Krasnow (Stanford)
Markus Affolter (Basel)
Jaques Prost (Paris)
Jonathan Knowles (Basel)
Michel Lazdunski (Nice)
Norma Andrews (New Haven)
Hans-Georg Kraeusslich (Heidelberg)
Pascal Cossart (Paris)
Kazuhiko Kinosita Jr (Okazaki)
Steve Harrison (Cambridge, USA)
Wolfgang Baumeister (Munich)
Special Sessions:
Local Organizers:
Cinema of the Cell: a festival of BioClips
http://www.bioclips.com
C. Sardet, SBCF council and
Nice Committee
European Life Scientist Organization
Information, Registration and Abstract Submission:
http://www.ELSO.org
In collaboration with
SOCIETE de BIOLOGIE CELLULAIRE
de FRANCE
http://sbcf.snv.jussieu.fr/
15.06.2004, 12:06 Uhr
W I S S E N S C H A F T
Paternale Vererbung
왔
Rekombination humaner
mitochondrialer DNA
Yevgenya Kraytsberg1, Marianne Schwartz2, Timothy A. Brown3, Konstantin Ebralidse1,
Wolfram S. Kunz5, David A. Clayton3, John Vissing4, und Konstantin Khrapko1
1
Harvard Medical School, Boston, MA, USA, Departments of 2 Clinical Genetics and
4
Neurology, National University Hospital Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark
3
Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA, 5 Department of Epileptology,
University Bonn, Bonn, Germany
Die humane mitochondriale DNA ist eine 16,5 kB große DNA-Sequenz die 13 Proteine (7 Untereinheiten der NADH:CoQ-Oxidoreduktase, das Cytochrom b, 3 Untereinheiten der Cytochrom c-Oxidase und 2 Untereinheiten der H+-ATPase), 22 tRNAs und 2 rRNAs kodiert. Die
hohe Kopienzahl dieses Genoms, eine relativ konstant hohe Mutationsrate von etwa einer
Mutation pro site pro Million Jahren und der maternale Erbgang machen Untersuchungen
von Sequenzvariationen dieser DNA für Evolutionsbiologen außerordentlich interessant. Eine
bisher allgemein akzeptierte Eigenschaft tierischer mitochondrialer DNA ist die klonale Vererbung und das Fehlen von Rekombination, die im Gegensatz dazu an vielen Pflanzen-, Pilzen- und Protozoaarten nachgewiesen wurde1. Nachdem die Rekombination von mitochondrialer DNA auch an Muschel- und Fischarten gezeigt wurde2, stellte sich die Frage nach der
möglichen Rekombination der mitochondrialen DNA des Menschen. Um dieses Problem zu
lösen, haben wir DNA-Proben des einzigen bisher in der Literatur dokumentierten Individuums mit paternaler Vererbung der mitochondrialen DNA untersucht3. In dessen Skelettmuskel koexistieren paternale und maternale mtDNA-Moleküle nebeneinander und können somit rekombinieren. Um mögliche Rekombinanten zu detektieren, haben wir eine long-range
PCR-Methode angewendet, die es erlaubt, einzelne mtDNA-Moleküle zu amplifizieren. Durch
ein Screening von 450 individuellen klonalen PCR-Produkten konnten wir 33 rekombinante
mtDNA-Moleküle nachweisen. Die molekulare Struktur dieser Moleküle erlaubt einen Rückschluß auf den Mechanismus des genetischen Transfers zwischen unterschiedlichen menschlichen mtDNA-Molekülen4.
Wenige rein paternale PCR-Produkte (BsrBIund ApaLI-positiv, 14793G und 73G) wurden
ebenfalls nachgewiesen, die auf nicht-kompletten initialen BsrBI-Verdau hinweisen. Zusätzlich dazu erhielten wir 33 PCR-Produkte,
die BsrBI-negativ, aber ApaLI-positiv waren.
Diese wurden als ‚potentielle‘ rekombinante
Moleküle einem detaillierten Sequenzier- beziehungsweise Restriktionsmapping unterzogen (mindestens zweimal pro Markerposition, siehe Abbildung). Ihre Sequenzen enthielten alternierende maternale und paternale Segmente, was eindeutig auf mtDNA-Rekombination hindeutet. Ein zusätzlicher Beweis für
das in vivo-Entstehen der rekombinanten Moleküle waren Kontrollexperimente, die mit einer 10 zu 1-Mischung von paternaler und
maternaler DNA durchgeführt wurden. In einem Screening von 150 PCR-Produkten, die
auf identische Weise erhalten wurden, wurden keine BsrBI-negativen und ApaLI-positiven PCR-Produkte gefunden.
Der Mechanismus der
mtDNA-Rekombination
Die rekombinanten mtDNA-Moleküle gehören zwei strukturellen Klassen an (siehe Abbildung) – Klasse 1, mit einer kurzen paternalen Sequenz, die in ein überwiegend maternales Molekül eingefügt ist und Klasse 2, mit
einer maternalen Sequenz, die von paternalen Sequenzen flankiert wird. Zusätzlich dazu
scheinen die Wechsel zur alternierenden Sequenz (siehe Abbildung, weiß dargestellt) in
„Hot spots“ zu clustern, die auf einen möglichen Rekombinationsmechanismus hindeuten. Der erste „Hot spot“ (bei etwa np 12000)
Nachweis von rekombinanten
mtDNA-Molekülen
Um nach möglichen rekombinanten Molekülen zu suchen, wurde die Skelettmuskel-DNA,
die paternale und maternale mtDNA in einem
Mischungsverhältnis von 10 zu 1 enthielt, mit
einem großen Überschuß der Restriktionsendonuklease BsrBI verdaut, die die paternale
mtDNA an der Position 14793G spaltet (siehe
Abbildung). Danach wurde eine Einzelmolekül-PCR durchgeführt, um jeweils 7 kb oder 9
kb große klonale PCR-Produkte zu erhalten:
zwischen np 11206 und np 1490 (7 kb-Produkt)
oder zwischen np 9036 und np 1490 (9 kb-Produkt). Eine ähnliche Technik wurde bereits
angewendet, um nukleäre DNA-Rekombinanten zu isolieren5. In der Einzelmolekül-PCR ist
jedes PCR-Produkt ein Klon identischer Moleküle, die von einer einzelnen DNA-Matritze stammen. Wir erhielten 300 solcher 7kbPCR-Produkte und 150 der 9 kb-PCR-Produkte, die mit BsrBI und ApaLI auf das Vorhandensein von Schnittstellen bei np 14793 (BsrBI) und np 73 (ApaLI) untersucht wurden. Wie
zu erwarten, war die überwiegende Zahl der
PCR-Produkte BsrBI- und ApaLI-negativ
(14793A und 73A) und somit rein maternal.
Strukturelle Karte der 33 rekombinanten DNA Moleküle im Skelettmuskel des Patienten mit paternaler
mtDNA Vererbung (© Science, modifiziert nach 4).
Die paternalen Segmente sind blau, die maternalen Segmente sind rot dargestellt. Segmente die paternale und maternale Bereiche verbinden (‘breakpoints’) sind weiß. Nichtuntersuchte Bereiche sind grau.
Die dicken vertikalen Linien stellen die Restriktionsstellen für BsrBI und ApaLI dar, die zum Screening
nach rekombinanten mtDNA-Molekülen verwendet wurden.
LABORWELT
31
16.06.2004, 16:25 Uhr
| 31
liegt nahe eines alternativen ‚mtDNA lightstrand‘ Replikationsbeginns (OL (alt), siehe
Abbildung), der eine ‚mtDNA heavy-strand‘
Replikationspausenstelle ist. Die mtDNA-Replikationspause in dieser Region könnte ein
rekombigenes 3‘-Ende hervorbringen, welches
ein Nachbar-mtDNA-Molekül invadiert und
somit durch Replikationsabschluß ein rekombinantes Molekül der Klasse 2 generieren
würde. Zwei andere Hot spots (bei etwa np
147 und np 190) co-lokalisieren mit dem 5’Ende der 7S-DNA – einem kurzen mtDNAFragment, welches durch frühzeitige mtDNAReplikationstermination in der D-loop entsteht. Deshalb läßt sich vermuten, daß die
mtDNA-Rekombinanten der Klasse 1 durch
ein sogenanntes ‚7S DNA-template-switching‘
entstanden sind, bei dem paternale 7S-DNA
von der D-loop freigesetzt wird und danach
maternale mtDNA invadiert.
Konsequenzen der mtDNARekombination beim Menschen
Der mögliche Einfluß des Nachweises von
mtDNA-Rekombination beim Menschen auf
Untersuchungen zur molekularen Evolution
hängt von mehreren Faktoren ab, deren quantitative Bedeutung zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch schwer abzuschätzen ist2. So gibt
es zur Zeit nur grobe Schätzungen zur Häufigkeit des ‚paternalen leakage‘ (10–3 bis 10–4
pro Befruchtung bei Mäusen6), die Häufigkeit beim Menschen ist dagegen unbekannt.
Zudem ist für einen Austausch von genetischer Information zwischen verschiedenen
mtDNA-Molekülen von entscheidender Bedeutung, daß die mtDNA-Moleküle tatsächlich miteinander in Kontakt kommen und
nicht in separaten Entitäten wie Zellen, Mitochondrien oder Nucleoiden segregieren.
Weitere Untersuchungen sind daher erforderlich, um die Auswirkungen des Nachweises
von mtDNA-Rekombination beim Menschen
auf Evolutionsuntersuchungen und auf die
Vererbung von pathogenen mtDNA-Mutationen abschätzen zu können.
Literatur
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Gillham, Organelle Genes and Genomes, Oxford University Press (1994)
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Med 347, 576-580 (2002)
Kraytsberg et al. Recombination of human mitochondrial DNA, Science
304, 981 (2004)
Yauk et al. High-resolution sperm typing of meiotic recombination in the
mouse MHC Ebeta gene, EMBO J 22, 1389-1397 (2003)
Gyllensten et al. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice, Nature
352, 255-257 (1991)
Prof. Dr. Wolfram S. Kunz
Bereich Neurochemie
Klinik für Epileptologie, Universität Bonn
Sigmund-Freud-Str. 25
D-53105 Bonn
Östrogenrezeptor Signaling
왔
Transkriptions- und ZellzyklusRegulation in normalem und
tumorigenen Brustgewebe
Ralf Hass, AG Biochemie und Tumorbiologie (OE6410), Medizinische Hochschule, Hannover
Diskussionen über den Einsatz einer Östrogen- (ERT) oder allgemeiner einer Hormonersatztherapie (HRT) zur möglichen Reduktion eines Brustkrebsrisikos sind derzeit mehr denn je in
den wissenschaftlichen und öffentlichen Focus gerückt. Die Substitution mit diesen Steroidhormonen beeinflussen vorzugsweise die metabolischen Aktivitäten von Endometrium, Ovar
und Mamma. Eine Reihe wissenschaftlicher Daten lassen die Interpretation zu, daß diverse
Risikofaktoren neben anderen negativen metabolischen Begleiterscheinungen das Karzinomrisiko favorisieren. Insbesondere Frauen mit früher Menarche, später erster Schwangerschaft
und später Menopause tragen ein erhöhtes Risiko. Das Bundesinstitut für Arzneimittel und
Medizinprodukte (BfArM, Bonn) hat Mitte Mai – nach Beschränkung des Anwendungsgebietes „Wechseljahresbeschwerden“ auf die Behandlung ausgeprägter Formen im August 2003
– auch die Zulassung von Hormonersatztherapie-Arzneimitteln zur Osteoporose-Prävention
auf Ausnahmefälle begrenzt. Änderungen in den Risikohinweisen müssen bereits zum 1. Juli
2004 umgesetzt werden.
In einigen großen klinischen Studien wurden
bei postmenopausalen Frauen, bei welchen
später ein Mammakarzinom auftrat, höhere
freie Östradiolspiegel gemessen als bei
gesundgebliebenen Frauen. Durch eine Überexposition wird vermutlich eine zellbiologische Kaskade normales Wachstum – Hyperplasie – Neoplasie ausgelöst. Dies läßt vermuten, daß das Risiko proportional zur kumulativen Östrogenexposition der Zelle ist.
Allerdings gestalten sich die Daten aus diesen Studien teilweise sehr widersprüchlich
bezüglich einer möglichen Assoziation zwischen Hormonersatz und Brustkrebs, da im
Gegensatz zu der häufig vorgenommenen
Pauschalisierung der Ergebnisse unbedingt
eine differenziertere und detaillierte Betrachtungsweise erforderlich ist. Diese ergibt sich
insbesondere hinsichtlich der Hormondosis,
der Kombination verschiedener Hormongruppen und ihrer Derivate (Östrogene, Gestagene, Androgene) sowie dem Applikationszeitpunkt (Alter der Patientinnen, pharmakokinetische und chronobiologische Unterschiede). Darüber hinaus wird derzeit anstatt einer Monotherapie eher die Kombinationstherapie (zum Beispiel Östrogen + Gestagen) favorisiert, wobei gerade hierfür, aufgrund der komplexen metabolischen Interaktionsmöglichkeiten keine ultimativen Daten vorliegen.
Komplexe Signaltransduktion
Die Komplexität dieses Systems beginnt bereits bei den Rezeptoren, wobei sowohl für
Östrogene, als auch für Gestagene oder etwa
Androgene jeweils zwei Typen von Rezeptoren aus der Familie der nukleären Steroidhormonrezeptoren bekannt sind. Obwohl die
verschiedenen Rezeptoren gewebsspezifisch
verteilt sein können, bewirkt die Co-Expression im gleichen Zelltyp häufig synergistische
oder antagonistische Effekte1. Allgemein –
dafür aber auch pauschalisiert – gilt, daß die
Östrogen- oder Progesteronrezeptor-Aktivierung über Dimerisierung eine hormoninduzierte Transkriptionsmaschinerie in Gang
setzt. Aus der Komplexität des bereits sehr
simplifizierten schematischen Rezeptoraufbaus erkennt man jedoch sehr schnell, daß
die Signalkaskade so ‚einfach’ sicher nicht
sein kann.
Neben diversen Bindungsstellen und Interaktionspartnern, welche die Funktionalität von Aktivatoren und/oder Repressoren
darstellen und für unterschiedlichste Modifikationen in Form von Methylierung, Acetylierung oder Phosphorylierung sorgen
können, existieren eine Reihe sekundär gekoppelter Signalmechanismen parallel zur
Rezeptormodifikation, die direkt auch eine
Chromatin-Umstrukturierung vornehmen
können2 oder in die Regulation der Zellzyklusprogression eingreifen3. Dabei können
diese Signalmechanismen biphasisch ablaufen. Einige dieser Effekte sind transient und
laufen innerhalb eines raschen engen Zeitfensters ab, so daß die Langzeitwirkungen
der Hormone weitere metabolische Umstellungen beinhalten müssen. Gerade beim
Östrogen werden unmittelbar schnelle Hormonsignale (steroid receptor fast-action
complex) und langanhaltende metabolische
LABORWELT
32 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
32
16.06.2004, 16:26 Uhr
Östrogenwirkungen unterschieden. Entsprechend müssen die Signale des Östrogens
vom Extrazellularraum in den Nukleus der
Zielzellen transportiert werden, um dort
über die Dimerisierung des nukleären Östrogenrezeptors (nER) unter anderem die transkriptionale Aktivität zu entfalten. Dies wird
erreicht über plasmamembranassoziierte
cytoplasmatische Östrogenrezeptoren
(mERs). Es gibt aktuell eine Reihe von Hinweisen, daß sich die mERs von den nERs
unterscheiden: durch alternative Splice-Varianten4, durch Aminosäuresubstitutionen5
oder durch Acylierungen6, die für die Plasmamembranassoziation verantwortlich
sind. Die östrogenvermittelte Aktivierung
des mER beinhaltet dann eine G-Protein gekoppelte Signalkaskade über eine Gai-Untereinheit zur Aktivierung des MAP-Kinase- und weiter des Akt/Proteinkinase B-Signalsystems7. Darüber hinaus konnte aktuell gezeigt werden, daß die Hormonproduktion sowie die Rezeptoraktivierung entwicklungsabhängig funktioniert. Diese ‚in vivo’Studien des aktivierten Östrogenrezeptors
ergaben weiterhin, daß eine rezeptorunabhängige Wirkung der Hormone existiert beziehungsweise eine hormonunabhängige
Rezeptoraktivierung erfolgen kann8.
on von oxidativen Streßprodukten in den
Tumorzellen hindeutet9. Vor kurzem wurde
in diesem Zusammenhang in einer unabhängigen Arbeit bestätigt, daß Östrogen über
den plasmamembranassoziierten mERa
durch eine G-Protein-vermittelte Signalkaskade in der Tat oxidativen Streß mittels des
eNOS-Systems induzieren kann10.
Im weiteren Verlauf des Vergleichs von
östrogeninduzierten normalen und tumorigenen Brustzellen konnte gezeigt werden,
daß die östrogenvermittelten morphologischen Unterschiede bei den Brustkrebszellen (MCF-7) im Vergleich zu den normalen
tung der Tumorzellen entwickeln, wäre dies
im Grunde ein diagnostischer Nachweis für
die ‚weniger maligne’ Population der Tumorzellen, da diejenige Subpopulation, deren Cytokeratine durch MMPs und andere
Extrazellularmatrixproteasen reduziert wurden, bedeutend höhere metastatische Kapazität besitzen sollten.
Neben diesen Resultaten läßt sich daher
allgemein resümieren, daß eine Reihe weiterer detaillierter Experimentreihen und differenzierter Schlußfolgerungen zur Wirkungsweise und dem komplexen crosstalk
von Steroidhormonsignalen und der dabei
Multiple Signalkaskade
Diese aktuellen Ergebnisse zeigen, daß
Östrogen und Progesteron eine multiple
Kaskade von Signalen induzieren können,
die in Abhängigkeit von den assoziierten Interaktionspartnern eine unterschiedliche
metabolische Wirkung entfalten können.
Weitere Parameter verkomplizieren dieses
System wie etwa die Abhängigkeit vom Entwicklungszustand, von der Hormonrezeptorexpression oder vom Zelltyp – insbesondere Unterschiede zwischen normalen
Brustepithelzellen und Brusttumorzellen.
Kürzlich veröffentlichte Studien dazu haben
sich genau mit der Charakterisierung dieser zentralen Parameter beschäftigt. Neben
einer Primärkultur von normalen humanen
Brustepithelzellen (HMEC) werden Brusttumorzellinien (MDA-MB-231, T47-D und der
rezeptortragende Subklon der MCF-7 Zellen) in vitro mit verschiedenen Östrogenkonzentrationen einmalig oder permanent über
einen längeren Zeitraum miteinander verglichen. Die Auswertung dieser zweidimensionalen Experimentreihe zeigte bedeutende Unterschiede hinsichtlich der Morphologie, der Zellzyklusprogression und biochemisch-metabolischer Parameter zwischen
den normalen und den tumorigenen Brustzellen9. So konnte in den Brusttumorzellen
eine signifikant verstärkte transiente proteolytische Aktivität durch eine selektive Aktivierung des 20S-Proteasomsystems im Vergleich zu hormonbehandelten normalen
Brustzellen nachgewiesen werden, was unter anderem auf eine erhöhte Akkumulati-
Simplifizierter schematischer Aufbau und Assoziationspartner am Beispiel des Östrogenrezeptors
Brustepithelzellen (HMEC) mit einer unterschiedlichen Expression von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) korreliert. So zeigten
Brustkrebszellen eine signifikante Induktion von MMP-1 und MMP-7 nach Östrogenstimulation, wogegen diese Zn2+-abhängigen Extrazellularmatrix-Proteasen in normalen Brustepithelzellen nach Östrogenstimulation deutlich herunterreguliert werden9.
Diese gegensätzlichen Wirkungen von
Östrogen in Brustkrebszellen im Vergleich
zu den HMECs werden auch durch das unterschiedliche Adhärenzverhalten der verschiedenen Zellpopulationen unter dem Einfluß von Östrogen bestätigt. In diesem Zusammenhang könnten Östrogene eine nicht
unbedeutende Rolle für das Metastasierungsverhalten bestimmter Brusttumore
spielen. Diese Resultate haben auch diagnostische Konsequenzen in der Hinsicht, daß
beispielsweise die Charakterisierung von
Mamma-Tumorzellen und insbesondere von
Mikrometastasen im Knochenmark weitgehend über die Expression von Cytokeratinen vorgenommen wird. Da diese Extrazellularmatrixproteine aber die Funktionalität
von Adhärenz und damit eine lokale Anhef-
rezeptorvermittelten intrazellulären Signalkaskade unbedingt notwendig sind, da sie
eine enorme pharmakokinetische und klinische Bedeutung beinhalten.
Literatur
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Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4807-4812 (2003)
Chambliss und Shaul, Endokr. Rev 23:665-686 (2002)
Ciana et al., Nature Med. 9:82-86 (2003)
Hass and Sohn, Signal Transduction 1-2:9-17 (2003)
Chambliss and Shaul, Endokr. Rev 23:665-686 (2002)
Prof. Dr. Ralf Hass
Biochemistry and Tumor Biology (OE6411)
Medical School
Carl-Neuberg-Str. 1
D-30625 Hannover
Tel.: +49-511-532-6080
Fax: +49-511-532-6081
eMail: hass.ralf@mh-hannover.de
LABORWELT
33
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| 33
B L I T Z L I C H T
Nukleinsäure-Separation
왔
Erhöhte DNA-Ausbeute und
kurze Aufreinigungszeit
Dr. Claudia Disqué, Helge Mühl, Prof. Dr. Michael Lorenz,
Molzym GmbH & Co.KG, Bremen
laren DNA-Bande oberhalb der 23 kb-Bande
des Markers (M, oberste Bande). Zudem sind
in Präparat 3 die in diesem Stamm vorhandenen low copy number-Plasmide durch die
extrem hohe DNA-Ausbeute deutlich zu erkennen (Abb. 1, Pfeile). Als Ergebnis des Reinigungsverfahrens wird genomische DNA
mit einer molekularen Größe von >50 kb gewonnen. Im Vergleich dazu wurde mit dem
Kit eines Wettbewerbers DNA-Abbau beobachtet, sichtbar an dem “Schmier” unterhalb
der hochmolekularen Bande (Abb. 1).
Die Molzym GmbH & Co.KG hat eine Mini Spin-Kit-Serie zur schnellen, einfachen und hocheffizienten DNA-Extraktion und Reinigung entwickelt und auf den Markt gebracht. Die Eigenschaften dieser Kits – Schnelligkeit, hohe Ausbeuten und Qualität der DNA – beruhen auf
einer Kombination aus verbesserten Lysebedingungen und einem neuen Reinigungsverfahren, das sich die zum Patent angemeldete „Cationen Complexation Technology“ und neuartige
Bindematrices zunutze macht. Angeboten werden Kits zur DNA-Reinigung aus Bakteriophagen, Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzen, Böden, Nahrungsmitteln, Gewebe, Blut und Zellkulturen. Neu ist auch ein Universal-Kit zur Reinigung von genomischer und Plasmid-DNA. Ein
besonderes Merkmal der Kits ist, daß ein uniformes DNA-Reinigungsprotokoll für alle Arten
der genannten Probenmaterialien verwendet wird. Mit diesem Protokoll können aus Lysaten
Gesamt-Nukleinsäuren in 10 Minuten, hochmolekulare genomische DNA durch RNase ABehandlung in 15 min gereinigt werden. Die DNA-Ausbeuten aus zum Beispiel 100 mg bestimmter Gewebearten können 80 µg überschreiten. Damit erreichen die PrestoSpin D Mini
Spin-Kits den Midi-Maßstab von Ausbeuten (>20 µg-100 µg).
Key Words: DNA-Reinigung, Mini Spin Verfahren, genomische DNA
Die gereinigte genomische DNA ist für alle
Downstream-Anwendungen geeignet einschließlich PCR und Hybridisierung zur genotypischen Analyse sowie Klonierung. Dabei wurden Verfahren zur effizienten und
schnellen Lyse (Tab. 1) mit einer neuen Trenntechnologie zur Reinigung von Nukleinsäuren, „Cation Complexation Technology“
(CCT), verbunden1.
Die Lyseprotokolle sind darauf abgestimmt, das Probenmaterial vollständig aufzulösen bzw. eine optimale Freisetzung der
Nukleinsäuren zu bewirken. Dies erfolgt entweder durch
– eine enzymatische Vorbehandlung mit anschließender Lyse in chaotropem Puffer
– enzymatischen Verdau in Lysepuffer oder
– direkten Einsatz von chaotropen Puffern
(Tab. 1).
Die chaotropen Puffer verhindern effizient
den Abbau der Nukleinsäuren. Abbildung 1
verdeutlicht dies anhand verschiedener Bakterien (DNA-Präparate 1-4, Molzym) durch
das Auftreten einer distinkten, hochmoleku-
Tab. 1: Lyse verschiedener Materialien und DNA-Isolierungszeiten mit der PrestoSpin D-Mini
Spin-Kit-Serie
Material
Maximale Menge
Behandlung
Bakterien*
oder 6 ml E. coli
Hefen
2 x 1010 Zellen
dann Lysepuffer
2 ml
bei OD600 >10
200 mg
Lysozym,
(90 min)***
Lyticase,
dann Lysepuffer
Mörsern,
dann Lysepuffer
Proteinase K
in Lysepuffer
Proteinase K
in Lysepuffer
Proteinase K
in Lysepuffer
Lysepuffer
Pilze
Pflanzen
Gewebe inkl.
Mausschwanz
Vollblut
Lambda
Zellkulturen
150 mg frisch,
50 mg getrocknet
200 mg
bzw. 1 cm
200 µl
5 x 1012 Phagen
aus 10 ml Lysat
107 Zellen
Lysepuffer
Gesamte DNAIsolierungszeit **
(Wettbewerber)
35 - 65 min
70 min
(150 min) ***
40 min
(50 min) ****
50 min
(55 min) ****
90 - 180 min
(180-280 min) ***
30 min
(30 min) ***
70 min
(270 min) ***
25 min (30 min) ***
* Gram-positiv (z.B. Bacillus) und Gram-negativ (z.B. Escherichia), ** Lyse plus Reinigung; 4 parallele Proben, *** Wettbewerber Q, **** Wettbewerber M
Abb. 1: Agarosegel-Elektrophorese von bakterieller DNA, die durch den PrestoSpin D Bug-Kit
isoliert wurde (je 1 ml Kultur). 1: Bacillus subtilis,
2: Escherichia coli, 3: Pseudomonas stutzeri, 4:
Halomonas sp. Als side-by-side-Vergleich wurde
DNA mit einem Mini Spin-Kit eines Wettbewerbers isoliert. Aufgetragen wurden jeweils 10 µl
der Präparate (100 µl Eluat). Pfeile: PlasmidBanden. M: Molzym Lambda HindIII-DNA-Marker
(oberste Bande 23 kb).
Für den DNA-Isolierungsschritt werden die
Lysate durch ein Bind-Wash-Elute-Reinigungsregime geschickt. Besonderheit der PrestoSpin D-Kits ist, daß für jede Art von Material immer dasselbe DNA-Reinigungsprotokoll verwendet wird. Das Lysat wird mit einem Bindepuffer vermischt, der die Bedingungen für die Adsorption von genomischer DNA
an die Matrix einstellt. Das Bindeprinzip und
die Reinigungsprozedur (CCT) unterscheiden
sich von der Anionenaustausch-Chromatographie und dem Aussalzeffekt auf Silika- oder
Glasfasermembranen. Gemäß CCT bindet
DNA über die Komplexierung von multivalenten Kationen wie Magnesium-Ionen an
negativ geladene Oberflächen1. Nach nur zwei
kurzen Waschschritten mit einer eingebundenen RNase A-Behandlung auf der Säule wird
die DNA in 50 bis 150 µl Elutionspuffer hochkonzentriert und in reiner Form gewonnen.
In Kombination mit CCT werden neue Bindematrices verwendet, die unter anderem aus
einer Mischung aus Sand und Tonmineralen,
LABORWELT
34 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
34
16.06.2004, 16:29 Uhr
B L I T Z L I C H T
Tab. 2: Typische Ausbeuten genomischer DNA mit der PrestoSpin D-Kitserie (RNase-Behandlung;
Elutionsvolumen 100 µl) im Vergleich zum Wettbewerb (Mini Spin-Säulenkits)
Material
Bakterien (1 ml)
E. coli (Gram-negativ)
B. subtilis (Gram-positiv)
Hefen (1 ml)
S. carlsbergensis
S. boulardii
Pflanzenblätter (100 mg)
Tomate
Arabidopsis
Weizen
Gewebe (30 mg)
Mausschwanz (1 cm)
Rattenlunge
Rattenleber
Vollblut (100 µl)
Lambda (6 x 1011 Phagen)
Ausbeute(E260 nm)
Molzym
Wettbewerber Q
Qualität(E260/280 nm)
Molzym
Wettbewerber Q
18,0 µg
15,5 µg
4,1 µg
14,1 µg
1,77
1,86
1,72
1,94
9,1 µg
22,7 µg
3,3 µg
2,7 µg
2,11
2,08
2,09
2,34
8,9 µg
10,6 µg
33,6 µg
2,9 µg
10,3 µg
13,6 µg
1,90
2,12
1,89
1,73
2,26
1,89
48,5 µg
21,8 µg
85,1 µg
2,0 µg
6,0 µg
21,6 µg
n.b.*
12,8 µg
2,4 µg
4,4 µg **
1,80
1,80
1,81
1,79
1,77
1,81
n.b.*
1,49
1,84
1,84 **
Literatur
[1]
PCR
kose Lysate innerhalb eines Zentrifugationsschritts von nur 30 Sekunden leicht passieren,
während die Nukleinsäuren binden. Ein wei-
왔
Neuer THEQ-Thermocycler
MWG Biotech hat einen neuen Thermocycler
entwickelt – den MWG THEQ Lifecycler
(Abb. 1). Die Basis des THEQ Lifecyclers bildet die Quad Circuit Thermal Engine, die Temperatursteuerung des Systems mit vier unabhängig voneinander ansteuerbaren Temperaturzonen. Acht Peltier-Elemente, die von
vier Sensoren kontrolliert werden, stellen eine
präzise Temperatursteuerung, -verteilung
sowie eine optimale Temperaturhomogenität
sicher.
Zur Vermeidung unspezifischer Bindungen während der Deckelaufheizphase kommt
die sogenannte THEQ ASP(Active Sample
Protection)-Technologie zum Einsatz: Nach
dem Start werden die Proben aktiv auf 4°C
gekühlt. Erst wenn die Polymerase durch die
Kühlung auf „Pause“ gestellt wurde, wird
der Deckel aufgeheizt. Dadurch kann die
Deckeltemperatur nicht mehr die Proben
undefiniert erwärmen und dadurch unspezifische Bindungen verursachen. Ist die Zieltemperatur für den Deckel erreicht, werden
die Proben aktiv auf die erste Zieltemperatur erwärmt und die PCR kann starten.
Durch Verwendung eines integrierten PCs
und eines 18,4 Zoll-Monitors mit Touchscreen-Funktion läßt sich die Software des
THEQ bedienen wie ein Windows-Pro-
Lorenz, M. Laborwelt Nr. 4 (2003), 40-41
* n.b. = nicht bestimmbar (gefärbtes Eluat)
** Gravitations-Durchflusssäule (Austauscher)
organopolymeren geladenen Faserfiltern oder
Diatomeenerde bestehen können. Ein Vorteil
vieler dieser Matrices ist, daß auch hochvis-
terer Vorteil ist die extrem hohe Bindekapazität der Matrices in Verbindung mit CCT (> 80
µg DNA) und die damit resultierende hohe
Ausbeute (Tab. 2), die deutlich in den MidiBereich der DNA-Mengenkategorisierung
reicht (>20 – 100 µg). Bei solch hohen Ausbeuten ist die DNA-Menge nicht mehr limitierender Faktor für Anwendungen wie Hybridisierungen. PrestoSpin D-Kits werden innerhalb
Deutschlands von Omnilab Life Science
(www.omnilab.de) vertrieben. Zur Auswahl stehen Spezial-Kits zur Reinigung von genomischer bzw. Plasmid-DNA im Midi-Maßstab als
auch ein universeller Kit zur Reinigung von
genomischer und Plasmid-DNA.
gramm. Zudem speichert das Program
Wizard™ die bei der PCR-Programmierung
wiederkehrenden Berechnungen – es müssen
nur noch Primer-Sequenzen, Template-Länge und DNA-Typ eingegeben werden.
Das System ist in verschiedenen Konfigurationen verfügbar:
– 3+1Server/Satellite-Kombination: Bis zu
vier Thermocycler können von einem Server-THEQ mit integriertem PC und
Touchscreen betrieben werden.
Prof. Dr. Michael Lorenz
Molzym GmbH & Co.KG
Leobener Strasse, UFT, Raum 1340
D-28359 Bremen
Tel.: +49-(0)421-218-8780, Fax: -218-8781
eMail: info@molzym.com, www.molzym.com
– PC-basierte Thermocycler-Bedienung: Da
PC- und Cycler-Software identisch sind,
können bis zu 48 THEQ von einem einzigen Steuer-PC aus bedient werden.
– USB Plug and Play-Verbindung: Netzwerk-Cycler werden über USB-Sticks verbunden
– Nutzer-Management: Der Administrator
kann Nutzerprofile mit unterschiedlichen
Zugriffsrechten definieren. So können etwa
die Rechte für das Löschen oder Editieren
von Programmen erteilt oder versagt werden.
– Es stehen zwei Report-Typen zur Auswahl: Labbook Report – kurze Laufbeschreibung im ASCII-Format und GLPReport – detaillierter Report im verschlüsselten, nicht editierbaren Format
– Barcode-Option: Barcodes können mit einem Handscanner gelesen und dokumentiert werden. In Kürze wird eine barcodeabhängige PCR-Programmauswahl zur
Verfügung stehen.
Das neue Gerät wird mit 196-well-GradientBlock (für 96 x 0,2 ml-Tubes und 96 well-Platten), mit 96-well-Gradient-Kombi-Block (für
48 x 0,5 ml96x 0,2ml Tubes und 96-well-Platten) sowie mit 384-well-Hochdurchsatz-Block
angeboten. Die Blöcke können ohne Werkzeug ausgetauscht werden.
Information
Holger Eggert
Internationaler Produktmanager THEQ
eMail: heggert@mwgdna.com
LABORWELT
35
16.06.2004, 16:29 Uhr
| 35
LW3_04_(36,39-43)_tg.okok
36
T3000 Thermocycler
30 cm x 38 cm (B x T)
Thermocycler mit drei unabhängigen Blöcken in
einem Gerät. Es können drei unterschiedliche
Programme gleichzeitig abgearbeitet werden.
3 Blöcke / Austausch nicht möglich
A: T3000 Thermocycler 20: 3 x 20 Gefäße à 0,5ml •
T3000 Thermocycler 48: 3 x 48 Gefäße à 0,2ml •
T3000 Thermocycler Kombi: 3 x 18 Gefäße à 0,5ml
bzw. 48 Gefäße à 0,2ml
B: T3000 Thermocycler 48 + Kombi: 48-wellMikrotiterplatte
C: keine
D: T3000 Thermocycler 48 und Kombi: 6 x 8erStreifen
nein
Peltiertechnologie
–3 °C bis 99,9 °C
Temperaturuniformität ± 0,5 °C,
Regelgenauigkeit ± 0,1 °C
SpeedCycler
B: 300mm; T: 410mm; H: 210mm
rapid PCR-Thermocycler: ein System, das die PCRZeiten deutlich verringert • bis zu 10fach höhere
Geschwindigkeit im Vergleich zu konventionellen
Thermocyclern • SAC-Technologie • Temp./Zeit
Increment • autom. Anpressen des Deckels und
einstellbarer Anpreßdruck • SPS – Sample Protection
System • Heizblockwechsel ohne Werkzeug • PC
Steuerung mgl. • Cycler-Netzwerke mgl
1 Block/ohne Werkzeug austauschbar
36er und 96er Block, Mikrotiterplatten, Tubes,
Objektträger
nein
High Power-Peltierelemente; massiver
goldbeschichteter Silberblock
0-100 °C
± 0,2 °C
2. Produktname
3. Standfläche
4. Thermocycler oder PCR-System:
Kurzbeschreibung
5. Anzahl der Blöcke/Austausch möglich?
6. Kapazität der Blöcke: A. Tubes, B. Mikrotiterplatten, C. Objektträger, D. Sonstige
7. Temperaturgradient über Block anlegbar?
Schritte in °C?
8. eingesetzte Heiz/Kühltechnik?
9. Temperaturbereich (von …bis °C)
Deckeltemperatur frei wählbar zwischen 30 und 110
°C, Smart Lid Technology für definierten
Anpreßdruck
k.A.
k.A.
Schnittstelle: Seriell RS232
Drei unabhängige Blöcke in einem Gerät • Smart
Lid Technology
Ja, bis zu 110 °C, autom. Anpressen an den Block,
Anpreßkraft wählbar
nein/nein
externer Probengeber möglich
nein/ja/RS 232
200 Programme im Gerät speicherbar, im PC ohne
Begrenzung
13. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar?
14. Probenvorbereitung: integriert/extern/nicht
möglich
15. PCR-Optimierungsprogramme/SoftwareUpgrades/Geräteschnittstellen
16. Extras
36 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
16.06.2004, 16:31 Uhr
24 Monate Garantie/Servicezentrale mit drei
Technikern in Göttingen
ab 9.350,– g
1 Jahr Gewährleistung/Ja/22
8.500,– g
17. Garantie/Service/Anzahl Servicetechniker
Deutschland?
12. Deckel beheizbar, sonstige
Eigenschaften?
T3000 Thermocycler 20: HR 2,1 °C/s/ KR 1,7 °C/s •
T3000 Thermocycler 48: HR 2,2 °C/s/ KR 2,0 °C/s •
T3000 Thermocycler combi: HR 1,4 °C/s/ 1,2 °C/s
10 °C/s (0,1-10 °C/s) / 6 °C/s (0,1-6 °C/s)
11. Heizrate/Kühlrate [°C/s]
10. Größtmögliche
Regeltemperaturabweichung
Biometra GmbH
Rudolf-Wissell-Str. 30
D-37079 Göttingen
Tel. +49-(0)551-50686-0
Fax +49-(0)551-5068666
eMail: biometra.info@whatman.com, www.biometra.de
Ansprechpartner: Dr. Markus Kapp
Analytik Jena AG
www.analytik-jena.com/
Ansprechpartner Alexander Berka
Tel.: +49-(0)-3641-777132
Fax: +49-(0)-3641-779279
eMail: a.berka@analytik-jena.de
–3 °C bis 99,9 °C
4 °C-100 °C
3,3 °C/s Heizen , 2,0 °C/s Kühlen
± 0,3 °C
ab 5.950,– g
24 Monate Garantie/Servicezentrale mit drei
Technikern in Göttingen
Goldbeschichteter Silberblock für hohe
Geschwindigkeit und eine sehr gute Temperaturuniformität • Temperaturgradient bis 40 °C • Smart
Lid Technology
Schnittstellen: Seriell RS232, parallel Centronics
k.A.
k.A.
7.690,– g mit 96-well-Thermogradientenblock
Garantie: 1 Jahr/Service: nach Bedarf und
Serviceverträge möglich/–
Bio-Rad PCR-Reagenzien
PCR Optimierungsprogramme:
Thermogradientenfunktion zur PCR-Optimierung •
Sopftware upgrades: Diskette oder download von
www.bio-rad.com/amplification/ •
Geräteschnittstellen: seriell, parallel
Probenvorbereitung extern
Deckeltemperatur frei wählbar zwischen 30 und 110 Deckel beheizbar bis 110 °C
°C, Smart Lid Technology für definierten
Anpreßdruck
Max Heizrate: 4 °C/s • Max Kühlrate: 3 °C/s
Temperaturuniformität ± 0,3 °C innerhalb von 15
sec, ,
Regelgenauigkeit 0/- 0,1 °C
Peltier/Luft
Temperaturgradient 1-25 °C über die Reihen A-H
Temperaturgradient möglich, max. 40°C
Peltiertechnologie
A. B. D. (8er stripes, 12er stripes)
4 Thermoblockformate auswechselbar (96well,
2x48well, 60well, 384well)
iCyclerTM modulares PCR-Thermocyclersystem zur
Kombination mit unterschiedlichen Thermoblockformaten (96well, 2x48 well, 60 well, 384well) für
die konventionelle PCR
26 x 55 x 23 cm (W x D x H)
iCycler iQTM
Bio-Rad Laboratories GmbH
Heidemannstr. 164
D-80939 München
www.bio-rad.de
Ansprechpartner: Dr. Marcus Neusser
Tel.: +49-(0)89-31884-132, Fax: +49-0)89-31884-123,
eMail: marcus_neusser@bio-rad.com
A: TGradient 48: 48 Gefäße à 0,5 ml • TGradient 96:
96 Gefäße à 0,2 ml
B: TGradient 96: 96-well-Mikrotiterplatte
C: in situ-Modul für 4 Objektträger erhältlich
D: TGradient 96: 12 x 8er Streifen
1 Block / Blockwechsel möglich
Thermocycler mit Gradientenfunktion
25 cm x 34 cm (B x T)
TGradient
Biometra GmbH
Rudolf-Wissell-Str. 30
D-37079 Göttingen
Tel. +49-(0)551-50686-0
Fax +49-(0)551-5068666
eMail: biometra.info@whatman.com, www.biometra.de
Ansprechpartner: Dr. Markus Kapp
Marktübersicht: PCR-Thermocycler
LABORWELT
LW3_04_(36,39-43)_tg.okok
39
LABORWELT
16.06.2004, 16:31 Uhr
4950,– g ohne Thermogradientensoftware
Please request a quotation from info@biotage.se
< 10.000,– bis 48.000,– g je nach Modell und Ausstattung
2 Jahre Garantie, Wartungsverträge möglich, Validierung und
Zertifizierung, vier Servicetechniker
Garantie: 1 Jahr/Service: nach Bedarf und Serviceverträge möglich/–
Deutschland?
Mehrfeld-Heiz-/Kühlsystem • Multisensor-Technologie •
Roboterintegration vorbereitet (Systeme sind vollständig fernsteuerbar) •
Blöcke mit motorbetriebenem Öffnungs-/Verschlußmechanismus
erhältlich • Inkubation von Objekträgern (in situ-Applikationen) und
Microarrays • HTP-Anwendung mit 384-Well-Blöcken (SpezialOberflächenbeschichtung)
Bio-Rad-PCR-Reagenzien • Thermogradientenfunktion mittles Softwareupdate
16. Extras
2 years warranty, 3 technicians in Germany
Intuitive Editorfunktionen zur Programmerstellung • Gradient Calculator
Screen • Touchdown-, Extend und Increment-Funktion • Externe
Steuersoftware „EasyEngine" zur Fernsteuerung und Protokollierung von
Laufdaten (PTC 200, PTC 221 Disciple, PTC 225 Tetrad) • Netzwerkfähig
(PTC 200, PTC 225 Tetrad) • VGA-Farbgrafikdisplay mit Echtzeitanzeige der
Temperaturmeßwerte (PTC 220 Dyad, PTC 240 Tetrad 2) • SoftwareUpgrades kostenlos/Schnittstellen: RS-232, teilweise parallel bzw. USBPort
Ja, Blöcke mit motorbetriebenem Öffnungsmechanismus und
programmierbarer Anpreßdruck-Justierung für Roboterintegration
verfügbar
Max. 3 °C/s
PCR-Optimierungsprogramme: Thermogradientenfunktion zur PCRUnlimited copies of software, free software upgrades
Optimierung • Sopftware-upgrades: Diskette oder download von www.biorad.com/amplification/ • Geräteschnittstellen: USB
Heated lid, centrifugal format
Deckel beheizbar bis 110 °C
Eigenschaften?
± 0,3 °C bei 90 °C
Air temperature: 5 °C/s, sample temperature: 2.5 °C/s.
2,5 °C/sec. heizen , 1.5 °C/sec. kühlen
-5 bis 105 °C
Integrated detection
25-99 °C
± 0.01 °C sample-to-sample variation (deviation between samples run at
the same time), ± 0.1°C precision (deviation between samples run at
different times)
4 °C -100 °C
± 0,5 °C
MJ-Modul/Peltier + Joule-Heater
Corbett Robotics CAS-1200
Air heated/cooled
Peltier/Luft
Temperaturbereich zwischen 30 und 105 °C • Gradient definierbar
zwischen 1 und 24 °C, inkl. Dynamic Ramping (Zieltemperaturen des
Gradienten werden zur gleichen Zeit erreicht, d.h. konstante
Inkubationszeiten)
nicht aufrüstbar
N/A. One of the key features is temperature uniformity
Temperaturgradient 1-25 °C über die Reihen A-H
Schritte in °C?
Monoblöcke: A: 60 0,5 ml Tubes • 96 0,2 ml Tubes •
B: 96 Well MT-Platte • 384 Well MT-Platte •
C: 4 Slides/Microarrays
Dualblöcke: A: 2 x 30 0,5 ml Tubes • 2 x 48 0,2 ml Tubes • 48 0,2 ml
Tubes + 30 0,5 ml Tubes
B: 2 x 48 Well MT-Platte
C: 2 x 16 Slides/Microarrays
Probenvorbereitung extern
D: 72 tubes
A. B. D. (8er stripes, 12er stripes)
PTC 200: 1 Reaktionsblock • PTC 220 Dyad/PTC 221 Disciple: 2
Reaktionsblöcke • PTC 240 Tetrad 2: 4 Reaktionsblöcke • 10
Reaktionsblocktypen, Austausch in < 10 Sek. möglich
N/A
1 Thermoblockformat (96well)
Thermocycler-System, bestehend aus vier Basiseinheiten und 10
Reaktionsblocktypen. Basiseinheiten können mit den vorkalibrierten
Wechselblöcken frei kombiniert werden.
möglich
Real-Time DNA Detection System
24 x 33 cm (PTC 200) bis 48 x 61 cm (PTC 240 Tetrad 2)
38 cm x 48 cm
25 x 44 x 21 cm (W x D x H)
MyCyclerTM Personal Cycler kompaktes PCR-System mit großem VGADisplay zur übersichtlichen und leichten Bedienbarkeit mit intuitiver
Programmierung. Algorithmische- und Block-Temperatursteuerung des
96-well-Thermogradientenblocks. Speicherung von 99 onboardProtokollen. GLP-konforme Dokumentation der Validierungsprotokolle.
3. Standfläche
Kurzbeschreibung
Biozym/MJ Research MultiCycler-System PTC 200, PTC 220 Dyad, PTC 221
Disciple, PTC 240 Tetrad 2
Corbett Research Rotor-Gene 3000
MyCyclerTM Personal Cycler
2. Produktname
Biozym Diagnostik GmbH
Postfach
D-31833 Hessisch Oldendorf
Tel.: +49-(0)5152-52430
Fax: +49-(0)5152-524320
eMail: support@biozym.com
www.biozym.com
Ansprechpartner: Helmut Prechel
Biotage AB
Tel.: +46 18 565900
eMail: info@biotage.se
Bio-Rad Laboratories GmbH
Heidemannstr. 164
D-80939 München
www.bio-rad.de
Ansprechpartner: Dr. Marcus Neusser
Tel.: +49-(0)89-31884-132, Fax: +49-0)89-31884-123,
eMail: marcus_neusser@bio-rad.com
T H E R M O C Y C L E R
| 39
LW3_04_(36,39-43)_tg.okok
40
40 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
16.06.2004, 16:32 Uhr
Deutschland?
16. Extras
Ja, mit justierbarer Andruckplatte
Eigenschaften?
möglich
elektr. Heizplatte • Keramik-Kühlgebläse
35.000 g
< 6.000,– g je nach Modell und Ausstattung
35.000-75.000 g 1-4 Module
2 Jahre Garantie/ 48 h europaweiter Kundendienst/
5 technische Mitarbeiter
Softwareupgrades kostenlos/ Schnittstellen on
demand
USB-Schnittstelle: Numerische und graphische Datenanalyse • Simultane wählbare Darstellung von Analyseparametern, Protokollen und Ergebnissen aller oder
einzelner Assays • Graphische Darstellung der 2. Ableitung des Cycle thresholds (ct) • Threshold automatisch
oder manuell einstellbar • Normalisierung gegen frei
wählbaren internen Standard • PCR-Protokolle in bis
zu 10 Untergruppen aufteilbar • Schmelzkurvenanalyse automatisch nach ct-Wert möglich • Automatische
und manuelle Threshold- und Hintergrundsubtraktion •
Exportfunktion der numerischen Daten in MS Excel und
der graphischen Daten als JPEG • Automatische druckfertige Reporterstellung • Zugriffsbeschränkung zur
Datenbank für mehrere Benutzer einstellbar
Transportkiste, Batterieadapter, Flexibilität (Random
Access)
23.900,.– g SYNCHRON (ohne real-time-Option)
89.000,– g INSYTE (mit real-time-Option)
extrem schnelles, integriertes Computersystem, Flash
memory card • 32-Channel Multikanal PMT (510-710
nm)(bei Option mit Real time) • für alle am Markt
erhältlichen Techniken und Farbstoffe • high speed
cycling: 35 Zyklen in 15 Minuten
1 Jahr/mit Verlängerungsoption/ full Service/
Applikations-Support/ 5 Servicetechniker
real-time-Detektion integriert
Probenvorbereitung extern (automatisiert)
Spezial ECP-Deepreach-Deckel – Deckelheizung nicht
nötig
15°C/sec
ambient – 100°C
0,1 °C
Intergriert
Extern siehe Genexpert
Raumtemperatur-100 °C
Zeit- und Temperaturuniformität: ± 1.0 s der
programmierten Zeit •
± 0.5 °C von 60 °C bis 95 °C
Heizrate:10 °C/s von 50 °C bis 95 °C • Kühlrate: 2.5 °C/s
von 95 °C bis 50 °C
Auch als portables System mit Batteriebetrieb für
Außeneinsatz erhältlich
Flexibel programmierbare Aufheiz- und
Transportkiste
Abkühlgeschwindigkeit • Slide Griddle: Aufsatz für vier
Objektträger • Einfache Programmierung mit Extend-,
Increment- und Slope-Funktion • Programmspeicher
für ca. 320 Programme • stabiles Metallgehäuse
2 Jahre Garantie/Wartungsverträge möglich,
2 Jahre Garantie/ 48 h europaweiter Kundendienst/
Validierung und Zertifizierung/vier Servicetechniker
5 technische Mitarbeiter
Intergriert
Vollautomatische Probenaufarbeitung mit integrierter
Real Time-PCR-Analyse. Details siehe
www.cepheid.com
Software für FDA/CE-zertifizierte Assays von Cepheid
Max. 2,5 °C/s (PTC 100-96VHB Gold)
Nein
elektr. Heizplatte • Keramik-Kühlgebläse
Raumtemperatur-100 °C
Zeit- und Temperaturuniformität: ± 1.0 s der
programmierten Zeit •
± 0.5 °C von 60 °C bis 95 °C
Heizrate:10 °C/s von 50 °C bis 95 °C • Kühlrate: 2.5 °C/s
von 95 °C bis 50 °C
Auch als portables System mit Batteriebetrieb für
Außeneinsatz erhältlich
MJ-Module/Peltier
0 bis 100 °C
± 0,5 °C bei 60 °C
freie Temparaturwahl für jede Reaktion
vorinstallierte Protokolle
Temperaturgradient horizontal und vertikal über den
96er-Tray • Maximalgradient über 40°C (0,1°C
Auflösung) E
CP-Heiztechnik/ highspeed turbulence air
ECP Striptubes, Einzeltubes und ECP96er-Trays
Tubes für 25 bzw 100 µl
Anwendungsspezifische Extraktionskartuschen
Schritte in °C?
16-96 Reaktionen (bei 6 Blöcken je 16 Tubes/Block) •
Blöcke austauschbar
1-4 Reaktionen
PTC 100-60, PTC 100-96V, PTC 100-96VHBGold, PTC
100-16ms: je 1 Reaktionsblock vier
Reaktionsblocktypen, Austausch im Service möglich
A: 60x0,5 ml Tubes • 96x0,2 ml Tubes
B: 96-Well MT-Platte • 48-Well MT Plate
C: 16 Slides/Microarrays und 24 0,2 ml Tubes oder 4
Objekträger (Aufsatz für Block 96 bzw. 60)•
Ltf-Labortechnik
Obere Ebenhalde 19
D-88142 Wasserburg
Tel.: +49-(0)-8382-98520, Fax: +49-(0)-8382-9852-32
eMail: info@labortechnik.com
www.labortechnik.com
INSYTE „real-time PCR System“
44 x 46 x 60 cm (Breite x Tiefe x Höhe)
ultraschnelles real-time PCR-System im 96-wellFormat • ECP-Technologie mit Heiz- und Kühlraten
von 15 °C und mehr • jedes der 96 wells stellt ein
autarkes Mini-PCR System dar, das mit völlig
unterschiedlichen Temperaturprofilen und Farbstoffen
gefahren werden kann • höchste FluorophorFlexibiltät: für alle auf dem Markt befindlichen
Farbstoffe geeignet • perfekte Temperaturauflösung
(0,01 °C)
96er-Format
Genexpert
ca. 30x30x30
Real-Time-PCR-System. (bis zu 4 I-CORE/DNAExtraction-Modulen, Dell Computer, Software)
Biozym/MJ Research MaxiCycler PTC 100
24 x 28 cm
Thermocycler mit fest installiertem Block
2. Produktname
3. Standfläche
Kurzbeschreibung
Cepheid s.a.
Vira-Solelh
81470 Maurens-Scopont, France
Tel.: +33-(0)-563-825300, Fax: +33-(0)-563-825301
www.cepheid.com
Ansprechpartner: Dr Andreas Eckelt
Tel.: +49-(0)2174-791909
Fax: +49-(0)2174-791908
eMail: eckelt@cepheid.com
Smartcycler
30x30x30
Real-Time-PCR-System. Separate Temperatur- und
Zeitansteuerung für jedes Tube ermöglicht simultane
oder zeitversetzte real-time-PCR-Assays mit
unterschiedlichen Protokollen. Komplettsystem
(Processing-Block mit 16 I-CORE-Modulen, Dell
Computer, Software, Mikrozentrifuge, Gefäßständer)
Cepheid s.a.
Vira-Solelh
81470 Maurens-Scopont, France
Tel.: +33-(0)-563-825300, Fax: +33-(0)-563-825301
www.cepheid.com
Ansprechpartner: Dr Andreas Eckelt
Tel.: +49-(0)2174-791909
Fax: +49-(0)2174-791908
eMail: eckelt@cepheid.com
Biozym Diagnostik GmbH
Postfach
D-31833 Hessisch Oldendorf
Tel.: +49-(0)5152-52430
Fax: +49-(0)5152-524320
eMail: support@biozym.com
www.biozym.com
Ansprechpartner: Helmut Prechel
LABORWELT
LW3_04_(36,39-43)_tg.okok
41
A. Universalblock für 96 x 0,2 ml-Tubes oder 48 x 0,5
ml-Tubes mit flachem Deckel • B. 96 well-PCRPlatten mit oder ohne Rand; 384 well-Block verfügbar
• C. In situ-Block verfügbar
Single-Block Gerät/austauschbar (96-well-Gradient/ 48- 1 Block pro Thermomodul, Varianten: 96-well1 Block; Austausch möglich
well-Gradient / 384–well/ In Situ-Flat Block/ Combiblock Aluminiumblock • 96-well-Silberblock • 384-well(96 x 0,2 ml und/oder 48 x 0,5 ml)
Aluminiumblock
Austausch möglich: „Advanced Block Exchange Concept"
Tubes/ Mikotiterplatten/ Objektträger (je nach Block)
Linearer Temperaturgradient durch spez . Blockdesign / Temperaturgradient über 12 Reihen (96-well Block) bzw. Nein
0,5-Grad-Schritte
24 Reihen (384-well Block): von 1°C bis 20°C (96-wellbzw. 384-well-Aluminiumblöcke); von 1°C bis 24°C (96well-Silberblock) • Temperaturbereich des Gradienten:
30°C bis 99°C • Eingabeschritte: 0,1°C
Schritte in °C?
Primus 96 advanced zu Gradientencycler nachrüstbar; Erstellen, Editieren und Kopieren von Programmen während eines Laufes möglich; GLPReports für lückenlose Aufzeichnung aller Läufe;
Optional: externe Speicherkarte für bis zu 50 Programme; Optional: Software zur Ansteuerung durch
PC; Vernetzung von bis zu 30 Thermocyclern möglich;
bei Primus 96 advanced Gradient: einfache Übernahme der optimalen Annealing-Temperatur in ein
Standard-PCR-Programm
24 Monate/ Service-Verträge erhältlich; GarantieVerlängerung gegen Aufpreis möglich/3 Servicetechniker in Deutschland
Ja; Deckeltemperatur zwischen 70 und 120°C
einstellbar; Deckelheizung abschaltbar; automatische
Höhenanpassung des Deckels
Nein/Nein
extern
Heizrate: 6°C (96-well-Silberblock) bzw. 4°C (96-wellund 384-well-Aluminiumblock) • Kühlrate: 4,5°C (96well-Silberblock) bzw. 3°C (96-wellund 384-wellAluminiumblock)
ESP-Heizdeckel-Technologie, motorisierbar
Mastercycler ep gradient und Mastercycler ep
gradient S: aufrüstbar für real-time PCR
Externe Probenvorbereitung durch epMotion5070 oder
epMotion5075 Liquid Handling-Workstation
PCR-Optimierung durch Gradienten-PCR, SoftwareUpgrades via Internet, Schnittstellen: 1 x Centronics,
1 x RS 232, Control Panel, je 1 x CAN_in / CAN_out
Mastercycler ep gradient (incl. Control Panel): 7.950 g • 2.465,– g
Mastercycler ep gradient S (incl. Control Panel): 8.950
g • Mastercycler ep 384 (incl. Control Panel): 8.300 g
(deutsche Listenpreise)
beheizbarer Deckel mit einstellbarem, motorisiertem
Anpreßdruck
keine Real-time-Detektion
Probenvorbereitung extern (CAS-1200 PCR-System)
Gradienten- und Run-Reports über Schnittstelle GLPkonform exportierbar/Printerport
Temperatur-Ramping • BlockTemperatur-Kontrollsonde Lizensiert und autorisiert für PCR • Mastercycler ep
GLP-Reports für lückenlose Aufzeichnung aller Läufe;
• Printer • Farbiges TFT
CycleManager (Steuerungssoftware für Mastercycle ep- Optional: Software zur Ansteuerung durch PC;
Netzwerk, aus bis zu 30 Thermocylern und GLPVernetzung von bis zu 30 Thermocyclern möglich
konforme Dokumentation relevanter PCR-Daten) •
Impuls PCR-Technologie für die „geräteseitig
unterstützte“ Hot Star- PCR • Externes Control Panel
mit VGA-Farbdisplay und graphischer Benutzeroberfläche• "Mini Satelliten-System" (Ein Control Panel
steuert bis zu fünf verschiedene Thermomodule)
2 Jahre Garantie/Technischer Service in Deutschland
(Tel.: 01803-355911)/k.A.
3°C/s
2 Jahre Garantie/Austauschservice/5 Servicetechniker
5900.-g inkl. Block
Eigenschaften?
möglich
16. Extras
Deutschland?
LABORWELT
16.06.2004, 16:32 Uhr
24 Monate/ Service-Verträge erhältlich; GarantieVerlängerung gegen Aufpreis möglich/
3 Servicetechniker in Deutschland
Nein/möglich/RS232 für PC-Anschluß, Centronics für
Druckeranschluß
2 °C/s
Regelgenauigkeit ± 0,1°C; Blockuniformität ± 0,7°C (bei
72°C)
4.165,- g bzw. 5.865,- g (mit Gradientenfunktion)
Nein/möglich/RS232 für PC-Anschluß, Centronics für
Druckeranschluß, PS/2 für externe Tastatur
extern
Nein/Nein
Ja; Deckeltemperatur zwischen 70 und 120°C
einstellbar; Deckelheizung abschaltbar; automatische
Höhenanpassung des Deckels; Deckelverriegelung
während des Laufes einstellbar; optional mit HighPressure Lid (HPL) oder Motor Lid erhältlich
2 °C/s
Regelgenauigkeit ± 0,1°C; Blockuniformität ± 0,35°C
(bei 72°C)
4 bis 105°C
Regelgenauigkeit: ± 0,2°C
± 0,4 °C
Peltier
4 bis 105°C
Peltier
Peltier-Elemente
Temperaturbereich: 4°C bis 99°C
Peltier
4°C bis 100°C
Bei Primus 96 advanced Gradient; maximaler
Gradient von 39,8°C zwischen 35 und 105°C; 0,1°CSchritte möglich
Zuverlässige Thermocycler für mittleren bis hohen
Probendurchsatz
31,5 x 31,5 x 29,5 cm (B x T x H)
A. Universalblock für 25 x 0,2 ml-Tubes oder 13 x 0,5
ml-Tubes mit flachem Deckel • B. Nein • C. Nein
Kompakter Thermocycler für kleine bis mittlere
Probenzahlen
96-well-Block (Alu oder Silber): 96 x 0,2 ml PCR-Gefäße
oder 1 PCR-Platte 96 • 384-well-Alublock: 1 PCR-Platte
384
1 Block/Cycler; Austausch möglich; mehrere Blöcke
verfügbar
Thermocyclerfamilie aus drei unterschiedlichen
Blockvarianten (96-well Aluminiumblock, 96-well
Silberblock, 384-well Aluminiumblock), die über ein
externes Control Panel (VGA-Farbdisplay) angesteuert
werden
Hochwertiger Gradientencycler (20°C Gradient) mit
Wechselblöcken (5 verschiedene Blöcke zur Auswahl) •
großer Farb-TFT-Touch-Screen (5,7 Zoll) • motorisierter
Heizdeckel mit einstellbarem Anpreßdruck • Datenport
für GLP-konformen Ergebnisreport
Kurzbeschreibung
Primus 96 advanced/Primus 96 advanced Gradient
26 cm x 41 cm x 30,5 cm (B x T x H)
23 x 24 x 22 cm (Breite x Tiefe x Höhe)
22,5 x 28,0 x 24,5 cm (B x T x H)
Primus 25 advanced
Mastercycler ep
Apollo ATC-401
2. Produktname
3. Standfläche
PEQLAB GmbH
Carl-Thiersch-Str. 2B, D-91052 Erlangen
www.peqlab.de
Tel: +49 (0)9131-610 70 20, Fax: +49 (0)9131-610 70 99,
info@peqlab.de
PEQLAB GmbH
Carl-Thiersch-Str. 2B, D-91052 Erlangen
www.peqlab.de
Tel: +49 (0)9131-610 70 20, Fax: +49 (0)9131-610 70 99,
info@peqlab.de
Eppendorf AG
D-22331 Hamburg
www.eppendorf.de
Ansprechpartner: Dr. Jens Klabunde (Marketing)
Tel.: +49-(0)-40-53801118,
eMail: klabunde.j@eppendorf.de
Ltf-Labortechnik
Obere Ebenhalde 19
D-88142 Wasserburg
Tel.: +49-(0)-8382-98520, Fax: +49-(0)-8382-9852-32
eMail: info@labortechnik.com
www.labortechnik.com
| 41
LW3_04_(36,39-43)_tg.okok
42
nein
Real-time PCR
1 Block, 96x 0,2 ml tubes oder Mikrotiterplatte, nicht
auswechselbar
kein Gradient
Hybride Peltier
4-99 °C
Blockuniformität: ± 0,25°C
System für Real-time online-PCR
Probenkarussell, Austausch möglich
32 Kapillaren
nicht zutreffend
Luft
40 bis 98 °C
0,15 °C
Kurzbeschreibung
Schritte in °C?
Max 1,7°C/, dynamisch
ja
ja
nein
Neue Softwareversionen werden kostenlos zur
Verfügung gestellt
Verwendung aller verfügbaren Chemien und Farbstoffe,
innerhalb des Emissionsspektrums von 350-380 nm,
Multiplexing mit bis zu vier verschiedenen Proben •
Dynamischer Bereich: 9 Größenordnungen. Intuitive
Software zur Quantifizierung (komparativ, quantitativ),
Schmelzkurvenanalyse und Allel-Diskriminierung. •
Robuste Kommunication zwischen PC und Instrument.
Uniformes und schnelles Thermocycling
Garantie/Service 2 Jahre
69.000 g
bis 20° pro Sekunde
nicht erforderlich
integriert, 6 Kanäle
extern
Updates/Software-Service enthalten.
Auswertesoftware für absolute und relative
Quantifizierung, qualitative Detektion, Schmelzkurvenanalysen – Genotypisierung und Tm calling
Garantie 1 Jahr, verlängerbar. System wartungsfrei/
Service zentral, auf Wunsch Austauschgerät während
Reparaturzeit
auf Anfrage
Eigenschaften?
möglich
16. Extras
Deutschland?
A: 20 x 0,5 ml tubes oder 25 x 0,2 ml tubes
76 x 46 x 51 cm, 50 Kg
28 x 50,5 cm plus PC
42 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
16.06.2004, 16:32 Uhr
29.500 g
Garantie/Service 2 Jahre/lieferbar ab September
Verwendung aller verfügbaren Chemien und Farbstoffe
innerhalb des Emissionsspektrums von 350-700 nm,
Multiplexing mit bis zu 4 verschiedenen Proben. •
Dynamischer Bbereich: 7 Größenordnungen
Neue Softwareversionen werden kostenlos zur
Verfügung gestellt
nein
ja
ja
Dynamisch, Max 2,5°C/s
Blockuniformität: ± 0,25°C
25-95°C,
Hybride Peltier
kein Gradient
1 Block, 96x 0,2 ml tubes oder Mikrotiterplatte, nicht
auswechselbar
Real-time PCR
33 x 46 x 43 cm, 20 Kg
Preis auf Anfrage
2 Jahre auf das Gerät sowie 4 Jahre auf den Block bei
max. 80.000 Zyklen/kompletter Service in Deutschland
kostenlose Software-Upgrades, RS-232-Schnittstellen
extern
nein
ja, ein- und ausschaltbar, stufenlos höhenverstellbar •
wählbare Deckeltemperatur: 100 °C bis 115 °C
3,0 °C/2,0 °C
± 0,5 °C
4 °C bis 99 °C
Peltiertechnik
1 Block, Austausch möglich
handlicher Personal-Cycler • integrierter beheizbarer
Deckel temperiert die Proben gleichmäßig • Steuerung und Programmierung über alphanumerische
Tastatur • Paßwortschutz möglich
(LxBxH): 33 x 17 x 19 cm
Personal-Cycler TC-312
3. Standfläche
MX3000P
MX4000
LightCycler PCR-System
Techne AG
Obere Hauptstraße 67b
D-09235 Burkhardtsdorf
Ansprechpartner: Dr. Jens Rösler
Tel.: +49-(0)-3721-271888
2. Produktname
Stratagene
www.stratagene.com
Kontakt: Technischer Service
Tel.: 00800-74007400/0031
eMail: tech_europe@stratagene.com
Stratagene
www.stratagene.com
Kontakt: Technischer Service
Tel.: 00800-74007400/0031
eMail: tech_europe@stratagene.com
Roche Diagnostics GmbH
Mannheim
Tel.: +49-(0)621-759-8568
LABORWELT
LW3_04_(36,39-43)_tg.okok
43
Multiblocksystem (MBS)
Standardblöcke : 20 x 29 x 30 cm (Breite, Höhe, Tiefe) nebeneinander
stapelbar • Roboterblöcke : 34 x 24 x 54 cm (Breite, Höhe, Tiefe) nebenund übereinander stapelbar
Herzstück des Multiblocksystems ist ein spezielles Computerprogramm
zur unabhängigen Ansteuerung von bis zu 30 unterschiedlichen Thermoblöcken. Einmal gestartet arbeitet der jeweilige Block unabhängig vom
Computer sein Programm ab, der Status aller Blöcke und die aktuelle
Temperaturkurve einzelner Blöcke können online beobachtet werden. Für
jeden Lauf wird ein komplettes Temperaturprofil als log-file abgespeichert. Für den hohen Probendurchsatz sind roboterkompatible,
stapelbare Blöcke erhältlich
Bis zu 30 Blöcke pro Steuereinheit (=PC), Blöcke sind einfach zu
installieren und auszutauschen.
Kapazität: abhängig vom Block-Typ:
HBMBS(G)05: 48 Röhrchen 0,5 ml oder 96 Röhrchen 0,3 ml oder 96-WellPlatte 0,3 ml • HBMBS(G)02: 96 Röhrchen 0,2 oder 96-Well-Platte 0,2 ml •
HBMBS384: 384-Well-Platte
0–15°C bei Gradientenblöcken
Peltier-Elemente
4–99°C
± 0.4°C innerhalb von 15 Sekunden
Gradienten-Cycler TC-512
(L x B x H): 42 x 22 x 26 cm
Gradienten-Cycler für hohen Probendurchsatz • Steuerung über großen
Touchscreen • graphische Anzeige der Temperaturentwicklung im Block
und des Gradienten • Blöcke in Sekundenschnelle austauschbar •
Lieferung mit Speicherkarte
1 Block, Austausch möglich
A: 96 x 0,2 ml tubes oder 60 x 0,5 ml tubes • PB: PCR-Platten 96well •
C: In-situ-Objektträger • D: 384 well-PCR-Platten
Gradient bei TC-512 möglich, Schritte 1 °C
Peltiertechnik
4 °C bis 99 °C
± 0,4 °C
2. Produktname
3. Standfläche
Kurzbeschreibung
LABORWELT
16.06.2004, 16:33 Uhr
nein
Komplette Automation inklusive Probenaufarbeitung lieferbar •
Integrierbar in vorhandene Probenvorbereitungssystemenein
RS485-Schnittstelle für Computersteuerung • Software-updates erhältlich
nein
extern
kostenlose Software-Upgrades, RS-232-Schnittstellen
möglich
1 Jahr Garantie/3 Personen für Thermocycler zuständig
Einblock-Startup (Computer, Software, 1 Standard-Block) 8.490 g •
Weitere Standard-Blöcke 5.450 g • Roboterkompatible Blöcke 8.720 g
Zwei Jahre auf das Gerät sowie vier Jahre auf den Block bei max. 80.000
Zyklen/kompletter Service in Deutschland
Preis auf Anfrage
Deutschland?
Spezielle aktive Temperaturkontrolle im Röhrchen ermöglicht
Sekundenprotokolle • Online-Kontrolle über bis zu 30 verschiedene
Blöcke per Computer
beheizbarer Deckel
ja, ein- und ausschaltbar, stufenlos höhenverstellbar • wählbare
Deckeltemperatur: 100 °C bis 115 °C
Eigenschaften?
16. Extras
Heizrate: maximal 3°C /s • Kühlrate: maximal 2°C/s
Heiz-/Kühlrate: 3,0 °C/1,3 °C
Schritte in °C?
Thermo Electron GmbH
Bioscience Technologies Division
Im Steingrund 4-6
D-63303 Dreieich
Ansprechpartner: Frau Miriam Wolf
Tel: +49-(0)-6103-408-1267
Fax: +49 (0) 6103-408-1212
eMail: miriam.wolf@thermo.com
Techne AG
Obere Hauptstraße 67b
D-09235 Burkhardtsdorf
Ansprechpartner: Dr. Jens Rösler
Tel.: +49-(0)-3721-271888
kompletter Thermocycler mit Bedieneinheit und Block 5.810 g •
Austauschblock 1.620 g
1 Jahr Garantie/3 Personen im Service für Thermocycler zuständig
Spezielle aktive Temperaturkontrolle im Röhrchen ermöglicht
Sekundenprotokolle
RS 232-Schnittstelle für Software-update
extern
nein
beheizbarer Deckel, Deckeldruck einstellbar
Heizrate: maximal 3°C/s • Kühlrate: maximal 2°C/s
± 0.4°C innerhalb von 15 Sekunden
4–99°C
Peltier-Elemente
0–15°C bei Gradientenblöcken
Kapazität: abhängig vom Block-Typ:
HBPXB(G)05: 48 Röhrchen 0,5 ml oder 96 Röhrchen 0,3 ml oder 96-WellPlatte 0,3 ml • HBPXB(G)02: 96 Röhrchen 0,2 oder 96-Well-Platte 0,2 ml •
HBMBS384 384-Well-Platte • HBPXBFB vier Objektträger
Einblocksystem, Block austauschbar
Der Px2 ist ein flexibler Thermocycler für den manuellen Betrieb mit
großem übersichtlichen Display. Er besteht aus einer Bedieneinheit und
einem austauschbaren Block. Es sind fünf verschiedene Blöcke erhältlich.
Durch die aktive Temperaturkontrolle im Röhrchen können die
Inkubationen sekundengenau ausgeführt werden.
24 x 25 x 39 cm (Breite, Höhe, Tiefe)
Px2
Thermo Electron GmbH
Bioscience Technologies Division
Im Steingrund 4-6
D-63303 Dreieich
Ansprechpartner: Frau Miriam Wolf
Tel: +49-(0)-6103-408-1267
Fax: +49 (0) 6103-408-1212
eMail: miriam.wolf@thermo.com
| 43
S T E L L E N M A R K T
Akademischer Stellenmarkt
Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt, der allen öffentlich-rechtlichen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi
Auflösung) an schnell@biocom.de. Annahmeschluß für die nächste LABORWELT-Ausgabe 4/04 (Erscheinungstermin 18.08.2004) ist der 6. August.
In der Abteilung Klinische Pharmakologie, Fachbereich Medizin, RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM ist ab
sofort eine
UNIVERSITÄTSKLINIKUM WÜRZBURG
BAYERISCHE JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITÄT
Postdoc-Stelle
(Dotierung bis C2) auf dem Gebiet der
kardiovaskulären Grundlagenforschung
zu besetzen.
Es handelt sich um eine universitätsinterne Stelle mit Limitationen gemäß HRG. Gesucht wird ein/e Post-Doktorand/in mit nachgewiesener eigener Projekterfahrung und Publikationsleistung, idealerweise mit Erfahrungen im Umgang mit Thrombozyten, Endothel- oder glatten Gefäßmuskelzellen. Bisheriger Schwerpunkt der Arbeitsgruppe ist die Signaltransduktion glatter Gefäßmuskelzellen bei Proliferations- und Differenzierungsprozessen. Der Postdoc sollte neben der Durchführung eigener Projekte
an der Anleitung junger Wissenschaftler (Diplomanden und Doktoranden)
Interesse zeigen und diese in seine Projekte integrieren. Neben ausreichendem Laborplatz stehen technische Assistenz und Verbrauchsmittel
zur Verfügung.
Ihre Bewerbungsunterlagen richten Sie bitte an:
Prof. Dr. Peter Reusch
Abteilung Klinische Pharmakologie
Universitätsstraße 150
D-44801 Bochum
Tel.: 0234 32-24884
e-mail: peter.reusch@rub.de
The Schools of Veterinary Medicine and
Medicine of the Justus Liebig University
Giessen, Germany, invite applicants for
their joint
Ph.D. program.
The Ph.D. program consists of a three-year graduate curriculum combined with an experimental project. Seminars and courses are conducted
in English; however, German courses are offered to our international students. A Master’s Degree or equivalent is required for entry into the program. Applicants may choose between four main tracks: Molecular
Veterinary Medicine, Vascular Biology, Cell-Cell Interaction in Reproduction, and Molecular Biology and Medicine of the Lung. The names
of prospective supervisors as well as materials required for the application are listed on
http://www.med.uni-giessen.de/phd2004
The Clinical Research Program Attention Deficit/Hyperactivity Syndrome
(ADHD) is a joint initiative of the Departments of Child/Adolescence and
Adult Psychiatry. The competence
center which is funded by the German
Research Foundation (DFG) investigates the relationship between molecular and functional mechanisms in the pathogenesis and therapy of ADHD with focus on the
long-term course of the disorder with interdisciplinary strategies.
Applications are invited for a
Junior Group Leader
in the area of “Genomic Imaging”
with focus on functional imaging and clinical electrophysiological
techniques (fMRT, SPECT, PET, NIRS). Integration of neuropsychological, neurophysiological, and imaging as well as molecular genetic strategies is the ultimate goal. The position is immediately
available for an initial period of 3 years, with an option of continuation on a tenure track. Funding includes the group leader position
(salary BAT Ia, approx. C 70.000/year), and on the basis of a research plan, 1 post-doc or 2 graduate students, one technician,
consumables and equipment.
Also immediately available are several
Postdoctoral Positions
Applicants must have completed a Ph.D. and should have two years
of postdoctoral experience with one of the following approaches:
Human molecular genetics (linkage/haplotype mapping) or advanced
molecular neurobiology techniques relevant to mouse genetics and
behavior (gene targeting & transgenics). The successful candidate
will join a multidisciplinary environment with rich collaborative opportunities in basic and clinical research (www.uni-wuerzburg/
nervenklinik/psychobiologie). Salary according to BAT IIa (approx.
C 58.000/year).
Applicants must contact supervisors before submitting their application.
Your application (postmarked by July 15, 2004) should be sent to the
following address:
Office of the President, Justus Liebig University Giessen, Attn.:
Ph.D. Program, PO Box 11 14 40, D-35390 Giessen, Germany
Please send cv & bibliography, a description of research experience, and the names of three references to: K.P. Lesch, M.D., Department of Psychiatry and Psychotherapy, Füchsleinstr. 15, 97080
Würzburg, Germany, E-mail: kplesch@mail.uni-wuerzburg.de
LABORWELT
44 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
LW3_04 Stellen_47-48
44
15.06.2004, 11:50 Uhr
GRADUIERTENKOLLEG MOLEKULARE VETERINÄRMEDIZIN
Institut für Molekulare Biotechnologie e.V.
Im Graduiertenkolleg Molekulare Veterinärmedizin am Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen sind zum 01.10.2004 folgende Stellen zu besetzen:
MITGLIED DER
WISSENSCHAFTSGEMEINSCHAFT
GOTTFRIED WILHELM LEIBNIZ E.V.
Jena / Thüringen
1. Nach den Vergaberichtlinien der Deutschen Forschungsgemeinschaft
10 Graduiertenstipendien (Promotion)
Das Kolleg bietet Promotionsarbeiten mit zell- und molekularbiologischer
Fragestellung an, die für zunächst 2 Jahre mit der Möglichkeit der Verlängerung um 1 weiteres Jahr vergeben werden. Wir empfehlen Ihnen, sich projektbezogen zu bewerben. Nähere Informationen über die 15 angebotenen
Promotionsthemen sowie das Ausbildungsprogramm können unter http://
www.vetmed.uni-giessen.de/grad-kolleg abgefragt werden. Sie müssen ein
abgeschlossenes Studium der Veterinärmedizin, Biologie, Humanmedizin,
Ernährungswissenschaft, Agrarwissenschaft oder sonstiger Naturwissenschaften mit qualifiziertem Abschluß vorweisen.
2. Für 2 Jahre
1 Wiss. MitarbeiterIn BAT IIa
für ein/e promovierte/n Wissenschaftler/in mit Expertisen auf dem Gebiet der
Herstellung transgener Tiere (k.o. Mäuse Cre-loxP-Methode, u. ä.). Weitere
Informationen auf der Homepage siehe oben.
Die Aufnahme in das Kolleg erfolgt nach persönlicher Vorstellung voraussichtlich in der 30.-31. Woche 2004.
Bitte richten Sie Ihre schriftliche Bewerbung mit den entsprechenden Zeugnissen und Studienunterlagen bis zum 01.07.2004 an:
Herrn Prof. Dr. E. Petzinger, Fachbereich Veterinärmedizin,
Graduiertenkolleg Molekulare Veterinärmedizin, Frankfurter Straße 94,
35392 Gießen (Fax 0641/99-38409).
Center for Life Science Automation
University of Rostock
As an international center of expertise, CELISCA offers an ideal environment for effective
interdisciplinary research and development projects. Under CELISCA's roof, engineers and
natural scientists will closely cooperate on finding innovative solutions for current and future
problems and tasks. CELISCA concentrates, promotes, and combines results and insights from
various disciplines (Automation & Engineering, Chemistry & Biotechnology, Screening &
Analytics, Real Time Information Technologies and Automation Assessment) in order to increase
knowledge and to develop better procedures and products for the life sciences more quickly than
ever.
For the development of a junior research group with focus on catalysis and drug development
and testing we are offering the position
Research Group Leader “Life Science Automation - Technologies”
Research topics of the group will include flexible automation of Life Science Processes, HTSMicroreaction Technology, Liquid-/Solid Delivery Systems, HTS-Analysis methods, Laboratory
Information- and Management Systems, Modelling / Simulation for automated processes in
Drug Development as well as distributed systems and sensor networks.
You have …
We offer …
• an outstanding PhD (Chemistry, Electrical
Engineering, Information Technology,
Physics)
• research experience in one or more of the
described topics
• experience in project oriented and funded
Research
• scientific occupation abroad / experience
in international cooperation
• excellent research facilities in direct
neighborhood of one of Germany’s most
beautiful seaside resorts
• strong existing research experience in the
described topics
• funding for five years upon BAT regulations
• complete laboratory set-up, consumables
and additional scientific and technical
personnel
We also expect experience in leading research groups, flexibility and the ability to work under
pressure, independend work, team spirit and social competence as well as interdisciplinarity.
For further information please contact:
Kerstin.Thurow@celisca.de • www.celisca.de
Applications should be addressed to:
CELISCA • Prof. Dr.-Ing. habil. Kerstin Thurow
Friedrich-Barnewitz-Str. 4 • 18119 Rostock
Germany
PhD student position
for the subject
“Cell type specific action of the Glucocorticoid Receptor”
Applications are invited for the position of a Ph.D. Student (BAT-O IIa/
2) to join a dynamic and independent research group (Molecular Biology of Tissue-specific Hormone Action, group leader Jan Tuckermann) at the Institute of Molecular Biotechnology in Jena.
Our research group is interested in the impact of the Glucocorticoid
receptor and interacting transcription factors such as AP-1, NFκB
and STAT5 in the immune system (Cell 93:531-541, J Cell Biol.
147:1365-1370, EMBO J 20:7168-73), bone metabolism (osteoporosis) and the self-renewal/differentiation of haematopoietic stem cells.
The successful candidate will be expected to work with cell type
specific mouse mutants generated by the cre-loxP system employed
in animal models for inflammatory diseases, osteoporosis and haematopoietic differentiation. These studies will be complemented by
the analysis of primary cells and embryonic stem cells derived from
those mice to explore the tissue specific regulation of cellular processes by glucocorticoids. Glucocorticoid-regulated target genes identified by micro-array analysis will be functionally evaluated by over
expression- and knock down-studies in primary cells by gene transfer with lentiviral vectors.
Applicants for the Ph.D. student position should be highly motivated
with genuine interest in both basic biological questions and in disease-oriented research projects. Previous experience in molecular,
biochemical and cell biological methods would be favourable.
The position is available initially for two years with possible extension. The research group of Jan Tuckermann is a part of the new research focus “Ageing and age related Diseases” of the Institute of
Molecular Biotechnology (IMB, Director Prof. Dr. Peter Herrlich) in
Jena, which contains a number of highly interacting groups, and
thereby creates a fruitful research environment.
If interested please send a short application including CV, statement
of research experience and interests, and names of two referees to
j.tuckermannn@imb-jena.de,Tel: +49-3641-65-6134, Fax: +493641-656335. Full applications including certificates and two letters
of recommendation should be sent to:
Dr. Jan Tuckermann
Institute of Molecular Biotechnology
Beutenbergstr. 11
D-07745 Jena
Deadline for applications is July 2, 2004. Interviews will be conducted in early July. Starting date is August 1, 2004, or later. IMB is an
equal opportunity employer.
LABORWELT
45
15.06.2004, 11:50 Uhr
| 45
Im Institut für Zytobiologie und Zytopathologie,
Zentrum für Hygiene und Med. Mikrobiologie
des Fachbereichs Medizin der
Philipps-Universität Marburg, ist eine
Center for Life Science Automation
University of Rostock
As an international center of expertise, CELISCA offers an ideal environment for effective
interdisciplinary research and development projects. Under CELISCA's roof, engineers and
natural scientists will closely cooperate on finding innovative solutions for current and future
problems and tasks. CELISCA concentrates, promotes, and combines results and insights from
various disciplines (Automation & Engineering, Chemistry & Biotechnology, Screening &
Analytics, Real Time Information Technologies and Automation Assessment) in order to increase
knowledge and to develop better procedures and products for the life sciences more quickly than
ever.
For the development of a junior research group with focus on catalysis and drug development
and testing we are offering the position
Research Group Leader “Life Science Automation - Applications”
Research topics of the group will include Drug Development, Leads, Biocatalysis /
Chemocatalysis, Assay-Development, High-Content Screening as well as Human-Machine
Interfaces and Automation Assessment.
You have …
We offer …
• an outstanding PhD (Chemistry, Biology,
Electrical Engineering, Information
Technology, Physics)
• research experience in one or more of the
described topics
• experience in project oriented and funded
Research
• scientific occupation abroad / experience
in international cooperation
• excellent research facilities in direct
neighborhood of one of Germany’s most
beautiful seaside resorts
• strong existing research experience in the
described topics
• funding for five years upon BAT regulations
• complete laboratory set-up, consumables
and additional scientific and technical
personnel
We also expect experience in leading research groups, flexibility and the ability to work under
pressure, independend work, team spirit and social competence as well as interdisciplinarity.
For further information please contact:
Kerstin.Thurow@celisca.de • www.celisca.de
Applications should be addressed to:
CELISCA • Prof. Dr.-Ing. habil. Kerstin Thurow
Friedrich-Barnewitz-Str. 4 • 18119 Rostock
Germany
Am Institut für Biochemie der
Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig ist eine
Doktorand(inn)enstelle Bat-O IIa/2
Biochemie/Biologie
zum nächstmöglichen Zeitpunkt für die Dauer von 2 Jahren zu besetzen
(Drittmittelprojekt finanziert durch die Wilhelm Sander-Stiftung).
Thema: 6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase –
Regulatorprotein im Glucosestoffwechsel gliogener Hirntumoren
Im Projekt wird am Modell gliogener Hirntumoren untersucht, ob die hohe aerobe Tumorglycolyse auf eine Überexpression der ubiquitären 6-Phosphofructo-2kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase (PFK2/FBPase2), ein Enzym mit protoonkogenen Eigenschaften, zurückzuführen ist. Es sollen das Vorkommen gliomspezifischer Isoformen der PFK2/FBPase2 auf Proteinebene und deren posttranslationale Modifikationen mit MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert
werden. Die „Tandem Affinity Purification“ (TAP) –Methode soll etabliert werden,
um Interaktionspartner der PFK2/FBPase2 in Gliomzellen zu identifizieren. Die
Ergebnisse sollen Möglichkeiten aufzeigen, den gestörten Zellstoffwechsel in
Gliomen auf der Ebene der PFK2/FBPase2-Expression sowie vor- und nachgeschalteter Signal- und Stoffwechselwege gezielt therapeutisch zu beeinflussen.
Angewandte Methoden:
쑲 Molekularbiologie (PCR, Klonierung)
쑲 Zellkulturen
쑲 Proteinreinigung (Immunopräzipitation, Affinitätschromatografie)
쑲 2D-Elektrophorese
쑲 MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Peptidmassen-Fingerprinting)
Kontakt: Prof. Dr. Klaus Eschrich, eMail: eschrich@uni-leipzig.de
Bitte senden Sie (nach E-Mail-Kontakt) Ihre Bewerbungsunterlagen an:
Prof. Dr. Klaus Eschrich, Institut für Biochemie,
Medizinische Fakultät Universität Leipzig, Liebigstr. 16, 04103 Leipzig
Doktorand(inn)enstelle BAT IIa/2
ab sofort für die Dauer von zunächst 2 Jahren zu besetzen (Drittmittelprojekt finanziert durch die DFG).
Das Aufgabengebiet umfaßt wissenschaftliche Dienstleistungen zur Organisation, Vorbereitung und Durchführung von Forschungsaufgaben,
insbesondere die Durchführung von Experimenten zur Biogenese von
Zymogengranula und zur Charakterisierung Granula-spezifischer Membranproteine in den Azinuszellen des exokrinen Pankreas unter Verwendung zellbiologischer und biochemischer Methoden.
Einstellungsvoraussetzung ist ein abgeschlossenes Hochschulstudium
mit geeignetem Schwerpunkt (Humanbiologie, Biologie, Biochemie/Chemie). Gewünscht sind Erfahrungen im Bereich Zellbiologie, Biochemie
und Molekularbiologie.
In vielen Bereichen der Universität sind Frauen unterrepräsentiert. Deshalb
sind Bewerbungen von Frauen besonders willkommen und werden in
Arbeitsbereichen, in denen Frauen unterrepräsentiert sind, bei entsprechender Qualifikation im Rahmen der rechtlichen Möglichkeiten mit Vorrang berücksichtigt. Bei gleicher Eignung werden bei der Auswahl
Schwerbehinderte bevorzugt.
Bewerbungen mit den üblichen Unterlagen sind zu richten an:
Dr. M. Schrader, Institut für Zytobiologie und Zytopathologie,
Robert-Koch Str. 6, 35037 Marburg,
eMail: schrader@mailer.uni-marburg.de
A PhD
student position or a MD/PhD
opening within a Graduate Program on Antigenspecific Immunotherapy is available by August 1 in the
Department of Hematology & Oncology at the
Johannes Gutenberg-University to study a variety of
aspects in T Cell Receptor Gene Therapy (Nature
Immunol 2001, 2: 962-970), such as signaling, T cell
memory pool formation, gene modified mice models,
and preclinical development. Due to grant regulations,
only members of EU countries are eligible.
Please send your application including cover letter, cv,
publication list, and names of up to three referees
(including email address & phone number) to:
Matthias Theobald, M.D.
José Carreras Leukemia Foundation Professor
Department of Hematology & Oncology
Johannes Gutenberg-University
Langenbeckstr. 1 • 55101 Mainz / Germany
Phone (49) 6131 - 175 047 • Fax (49) 6131 - 393 3364
theobald@3-med.klinik.uni-mainz.de
LABORWELT
46 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
46
15.06.2004, 11:51 Uhr
TECHNISCHE
UNIVERSITÄT
MÜNCHEN
Am Lehrstuhl für Botanik der TU München ist
ab dem 01.12.04 im Rahmen der Projekte Wachstumsregulation und Signaltransduktion von Abscisinsäure in Arabidopsis,
Funktionsanalyse von regulatorischen Proteinen
eine Doktorandenstelle - Vergütung nach BAT zu besetzen.
Voraussetzungen:
Studium der Biologie, Biochemie oder Molekularen Biotechnologie; Erfahrungen in molekularbiologischen Techniken erforderlich.
Bewerbungsschluss: 31.08.04
Ihre Bewerbung richten Sie bitte an:
Prof. Dr. E. Grill
Lehrstuhl für Botanik - TUM
Biologikum - Weihenstephan
Am Hochanger 4, 85354 Freising
Fachbereich Biowissenschaften, Lehrstuhl für Biophysik
Im Rahmen des BfS-Forschungsprojektes „Untersuchungen
zu Wirkmechanismen an Zellen unter Exposition mit hochfrequenten elektromagnetischen Feldern der Mobilfunktechnologie. A Demodulation/Kommunikation“ suchen wir ab sofort
einen/eine Doktorand/Doktorandin
Ihr Aufgabenbereich umfaßt die wissenschaftliche Mitarbeit im o.g. Projekt.
Dazu zählen Abschätzungen zur subzellulären Feldabsorption, die Modellierung
der elektrischen Zellstruktur sowie Messungen an Einzelzellen.
Einstellungsvoraussetzung ist ein Hochschulabschluß in einem naturwissenschaftlichen Fach, möglichst mit Erfahrungen auf dem Gebiet der Biophysik.
Idealerweise verfügen Sie über Erfahrungen mit der Technik der Messung und
Theorie elektrischer Zell- und Gewebeeigenschaften sowie Kenntnisse in der
aktuellen Literatur zur Wechselwirkung elektromagnetischer Felder mit biologischen Materialien. Hohe Eigenständigkeit bei der Zusammenarbeit mit den Projektmitarbeitern wird erwartet.
Die Stelle ist bis zum 30.06.2006 befristet. Die Vergütung erfolgt nach BAT (0,5
BAT-O IIa).
Die Universität Rostock strebt eine Erhöhung des Anteils von Frauen am wissenschaftlichen Personal an und fordert qualifizierte Frauen nachdrücklich auf, sich
zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei der Stellenbesetzung im Rahmen
der geltenden gesetzlichen Bestimmungen bevorzugt behandelt. Bewerbungsund Fahrtkosten können vom Land Mecklenburg-Vorpommern nicht übernommen werden.
Anfragen und Bewerbungen richten Sie bitte an:
Prof. Dr. J. Gimsa, Fachbereich Biowissenschaften, Lehrstuhl für Biophysik
Universität Rostock, D-18051 Rostock, Tel.: (0381)494 2037
PAUL-EHRLICH-INSTITUT
Das Paul-Ehrlich-Institut ist eine wissenschaftliche Einrichtung des Bundes, die als Bundesoberbehörde für die Zulassung und Chargenprüfung
immunbiologischer Arzneimittel zuständig ist und auf den damit verbundenen Gebieten der Lebenswissenschaften (z.B. Virologie, Bakteriologie,
Allergologie, Immunologie, Hämatologie, Medizinische Biotechnologie)
Forschung betreibt.
Im Fachgebiet – Virusimpfstoffe – der Abteilung Virologie ist zum nächstmöglichen Zeitpunkt die Position einer/eines
Wissenschaftlichen Angestellten
(Virologin/Virologen/)
Stellenbewertung:
BAT IIa / Ib zu besetzen.
Aufgabenprofil:
컄 Durchführung und Überwachung aller Laborvorgänge zur
staatlichen Chargenprüfung von Lebendvirus-Impfstoffen
컄 Organisation der prüfungsbegleitenden Forschung
컄 Wissenschaftliche Betreuung und Anleitung des Laborpersonals
컄 Mitarbeit bei der Bewertung von nationalen und europäischen
Zulassungsanträgen und dem damit assoziierten administrativen
Umfeld
컄 Kooperation mit anderen europäischen Zulassungs- und
Prüfbehörden
컄 Mitarbeit bei der Durchführung von Ringversuchen und Studien zum
Nachweis der Laborkompetenz
컄 Mitarbeit bei der Etablierung eines hausinternen Qualitätskontrollund Sicherungssystems
Anforderungsprofil:
컄 Abgeschlossenes naturwissenschaftliches Hochschulstudium
컄 Promotion mit Schwerpunkt Virologie
컄 Umfangreiche Erfahrungen im biologischen Sicherheitslaborbereich,
insbesondere im Umgang mit Gewebekulturzellen und Lebendviren
컄 Umfangreiche Erfahrungen im tierexperimentellen Bereich, insbesondere zur Sicherheits- und Wirksamkeitsbestimmung von Impfstoffen
컄 Kenntnisse zu den Herstellungsprozessen von Lebendvirusimpfstoffen
컄 Erfahrung in der Anleitung von Laborpersonal
컄 Fließendes Englisch in Wort und Schrift
컄 Sicherer Umgang mit Statistikprogrammen und Standard
Computer-Software
컄 Team- und Integrationsfähigkeit
Das Beschäftigungsverhältnis ist zunächst auf 3 Jahre befristet;
die wöchentliche Arbeitszeit beträgt 38,5 Std./Wo.
Die Eingruppierung erfolgt gemäß den tariflichen Bestimmungen des
Bundesangestelltentarifvertrages (BAT).
Auswärtigen Bewerbern ist das Amt bei der Wohnraumbeschaffung behilflich. Trennungsgeld und Umzugskosten werden nach den gesetzlichen
Vorschriften gewährt. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung
bevorzugt berücksichtigt.
Bewerbungen mit Lebenslauf, Lichtbild und kurzer Darstellung des beruflichen Werdegangs sowie Zeugnisabschriften richten Sie bitte bis zum
02.07.2004 an das Personalreferat des Paul-Ehrlich-Instituts.
Paul-Ehrlich-Institut | Paul-Ehrlich-Straße 51 - 59 | 63225 Langen
LABORWELT
47
15.06.2004, 11:53 Uhr
| 47
TECHNISCHE
UNIVERSITÄT
MÜNCHEN
In der Abteilung Molekulare und Experimentelle Chirurgie der Chirurgischen Klinik
ist eine Postdoc-Stelle zu besetzen.
POSTDOC IN MOLEKULARER ZELLBIOLOGIE
Am Lehrstuhl für Botanik der TU München ist
ab dem 01.12.04 im Rahmen des Projektes Xenobiotika-Stoffwechsel bei Pflanzen
eine Doktorandenstelle - Vergütung nach BAT zu besetzen.
In diesem Projekt soll die Detoxifizierung von Fremdsubstanzen mit molekularbiologischen Methoden an der Modellpflanze
Arabidopsis analysiert werden.
Voraussetzungen:
Studium der Biologie, Biochemie oder Molekularen Biotechnologie; Erfahrungen in biochemischer Analytik und in molekularbiologischen Techniken erwünscht.
Bewerbungsschluß: 31.08.04
Ihre Bewerbung richten Sie bitte an:
Prof. Dr. E. Grill
Lehrstuhl für Botanik - TUM
Biologikum - Weihenstephan
Am Hochanger 4, 85354 Freising
MENSCHLICHER ERKRANKUNGEN
Erforscht werden molekulare Mechanismen der Angiogenese und Endothelzellaktivierung bei Entzündungserkrankungen und Virusinfektionen. Ein Schwerpunkt liegt auf Untersuchungen zur Funktion des Guanylat-Bindungsproteins-1
(GBP-1) und auf der Entwicklung von Methoden zum Einsatz von GBP-1 für die
anti-angiogene Tumortherapie. Weitere Informationen unter: Guenzi et al., EMBO
J. (2001, 2003); Lubeseder-Martellato et al., Am. J. Pathol. (2002); Naschberger
et al., Biochem. J. (2004); http://www.gsf.de/imv/vascul/staff.html.
Der/die erfolgreiche Bewerber/in wird eine von drei Untergruppen mit jeweils 12 Doktoranden und einem technischen Mitarbeiter in sehr gut und modern ausgestatteten Laborräumen leiten.
Kandidaten sollten über mehrjährige Postdoc-Erfahrung in Molekularbiologie,
Virologie, Zellbiologie, Immunologie oder Biochemie verfügen. Sie sollten hohe
Kompetenz in molekularbiologischen und zellbiologischen Techniken und sehr
gute analytische und kommunikative Fähigkeiten besitzen.
Die Bezahlung erfolgt nach BATIIa/C1. Die Position steht für 5 Jahre zur Verfügung. Nach zwei Jahren erfolgt eine Zwischenevaluation. Die Position ist ab 1.
Juli 2004 verfügbar.
Bitte richten sie ihre Bewerbung mit Curriculum Vitae, Zusammenfassung ihrer
Forschungstätigkeit, drei Sonderdrucken sowie Namen und Anschriften von zwei
Referenzen an:
Prof. Dr. Michael Stürzl, Abteilung Molekulare und Experimentelle Chirurgie
Chirurgische Klinik mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität
Schwabachanlage 10 91054 Erlangen
eMail: michael.stuerzl@chir.imed.uni-erlangen.de
Technische Universität Berlin
Juniorprofessor/in
Besoldungsgruppe W 1 für das Fachgebiet „Methoden der Lebensmittelbiotechnologie“, Fakultät III: Prozeßwissenschaften der Technischen Universität Berlin, Institut für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie
Besetzbar ab 01.11.2004
Aufgabengebiet: Wahrnehmung der Lehre und Forschung auf dem Gebiet der Lebensmittelbiotechnologie. Schwerpunktthemen können sein: Moderne Methoden
der Lebensmittelbiotechnologie pflanzlicher Zell- und Gewebekulturen unter dem Aspekt gesundheitsbezogener Lebensmittel sowie Stressmechanismen von Zellen.
Durchführung von Lehrveranstaltungen, auch in englischer Sprache, auf dem Gebiet der Lebensmittelbiotechnologie, insbesondere für die Studierenden der Lebensmitteltechnologie, Lebensmittelchemie und Biotechnologie.
Anforderungen: Erwünscht ist Erfahrung in Lehre, Forschung und Entwicklung. Tiefergehende Kenntnisse über moderne Aspekte und zukünftige Entwicklungen
auf dem Gebiet der Lebensmittelbiotechnologie sind notwendig.
Der/Die Stelleninhaber/in soll Aufgaben in Wissenschaft, Forschung und Lehre in dem Fach selbständig wahrnehmen. Die Arbeitsbedingungen sollen, soweit allgemeine dienst- und haushaltsrechtliche Regelungen nicht entgegenstehen, den Rechten und Pflichten der Professoren/innen entsprechen. Das Berufungs- und Einstellungsverfahren ist an die Bestimmungen des Berliner Hochschulgesetzes über die Berufung von Professoren/innen angelehnt.
Einstellungsvoraussetzungen sind – neben den allgemeinen dienstrechtlichen Voraussetzungen – ein abgeschlossenes Hochschulstudium der Fachrichtung, pädagogische Eignung für die akademische Lehre sowie die besondere Befähigung zu vertiefter selbständiger wissenschaftlicher Arbeit, die in der Regel durch eine
herausragende und zügig abgeschlossene Promotion nachgewiesen wird. Sofern vor oder nach der Promotion eine Beschäftigung als wissenschaftliche/r Mitarbeiter/in erfolgt ist, sollen Promotions- und Beschäftigungsphase zusammen nicht mehr als 6 Jahre betragen haben (Mutterschutz-, Erziehungs- bzw. Elternzeiten
werden auf diese Frist nicht angerechnet).
Die TU Berlin ist sehr daran interessiert, qualifizierte Frauen für den Einstieg in die Hochschullehrerinnenlaufbahn zu gewinnen. Wir möchten daher Wissenschaftlerinnen ausdrücklich zu einer Bewerbung ermutigen. Bei gleicher Qualifikation werden Frauen bevorzugt eingestellt (dies gilt für Bereiche, jeweils bezogen auf Besoldungs-, Vergütungs- oder Lohngruppen, in denen mehr Männer als Frauen beschäftigt sind). Schwerbehinderte werden bei Eignung bevorzugt.
Technische Universität Berlin
TU Berlin, Service-Center der Fakultät III, Sekr. MA 5-11, Straße des 17. Juni 136, D-10623 Berlin
Berufungskommission o.E. der FK III zur Besetzung der Junior-Professur „Methoden der Lebensmittelbiotechnologie“
Tel.: +49/(0)30/314-24102 2, Fax: +49/(0)30/314-25965, eMail: melanie.geiler@tu-berlin.de
LABORWELT
48 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
48
15.06.2004, 11:53 Uhr
Im Institut für Anatomie und
Zellbiologie der Medizinischen
Fakultät der Martin-LutherUniverität Halle ist die Stelle
eines/-r
wissenschaftlichen Mitarbeiters/-in
zu besetzen.
Bewerber sollten über sehr gute Kenntnisse in allen Teilgebieten der Anatomie, theoretische Kenntnisse in zell- und
molekularbiologischen Untersuchungstechniken und über
Kenntnisse des Energiestoffwechsels bei Säugetier-Embryonen verfügen.
Eine Beteiligung bei der Durchführung von Lehrveranstaltungen ist erwünscht.
Voraussetzung ist ein abgeschlossenes Studium der Medizin oder gute medizinische Kenntnisse nach einem Hochschulabschluß in einem naturwissenschaftlichen Studium.
Kontaktadresse:
Institut für Anatomie und Zellbiologie
Große Steinstraße 52
D - 06097 Halle / Saale
eMail: bernd.fischer@medizin.uni-halle.de
Postdoctoral research position
Opening for a postdoctoral research associate at the
Martin-Luther-University Halle-Wittenberg, Germany
A position for a postdoctoral research associate will
become available in the group of molecular genetics of
sex determination. The research project will be in the area of molecular mechanism of sexual
regulation and transcription differences of instinctive behavior.
Topic: Genetics, molecular and cellular characterization of the CSD Protein activation and its
interaction with a downstream target gene. CSD is the initial signal of sexual regulation in a
number of insects. Sexual differentiation in these organisms is governed by allelic composition of the csd gene and not by the presence of sex specific chromosomes. We have isolated
the novel gene by positional cloning in the honey bee. The aim of the research project is to
elucidate the molecular mechanisms by which CSD allelic combinations activate a downstream target gene. The project include the development of reporter gene and splicing assays
and co-immunoprecipitation techniques. These approaches will give new insight of how sex is
regulated in these organisms and how this relates to other sex-determining mechanisms e.g.
in Drosophila. This research project is part of our major goal to understand principles of molecular decision making, the processes of molecular adaptation and the differentiation of regulative hierarchies.
In another project candidate genes for honey bee behavior are identified by microarray analyses. The identified genes will be a basis to further elucidate the molecular nature of instinctive
driven behavior. The development of diagnostic transcription profiles will enhance specific
selection programs of honey bees.
Molecular biology and genetics in honey bees is a new and fast evolving field with the opportunity to establish various research fields. The upcoming completed honey bee genome sequence will be a splendid tool to address various fundamental biological questions.
Candidates should have excellent research and distinctive molecular technique experience
preferably in protein binding, splicing reaction assays and microarray techniques (data analysis and management).
Starting: as soon as possible, for 2 years at first , Salary: Post-doc (Postdoktorandenstelle BAT IIa)
An application should include a cover letter explaining the particular interest in the field, CV,
copies of academic certificate, selected reprints and addresses from two references to:
beye@zoologie.uni-halle.de
Dr. Martin Beye, Martin-Luther-Universitaet Halle-Wittenberg,
Inst Zoologie, Raum 2.21, Biozentrum, Weinbergweg 22, 06120 Halle, GERMANY
phone ++49 345 55 21627 or 21631, fax ++49 345 55 27230
http://www.biozentrum.uni-halle.de/Bienengenetik/index.htm
Kontakt zu Verbänden
Neu: Im Jahr 2004 erscheint LABORWELT zweimonatlich. Alle Abonnenten des Branchen-Magazins |transkript sowie die Mitglieder der nachfolgenden Gesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für einen Beitritt
interessiert, erreicht die Gesellschaften unter folgenden Kontaktdaten:
DECHEMA
Verband Deutscher Biologen
Fachsektion Biotechnologie
Theodor-Heuss-Allee 25
D-60486 Frankfurt/Main
Tel.: +49-(0)-69-7564-289
Fax: +49-(0)-69-7564-272
www.dechema.de
Deutsche Gesell. für Proteomforschung
c/o MPI für Biochemie
Am Klopferspitz 18a
D-82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)-89-8578-3964
Fax: +49-(0)-89-8578-2802
c.kleinhammer@dgpf.org
www.dgpf.org
Österreichische Gesell. für Biotechnologie
c/o Boehringer Ingelheim
Austria GmbH
Dr. Boehringer-Gasse 5-11
A-1121 Wien
Tel.: +43-(0)-1-80105-2311
Fax: +43-(0)-1-80105-9311
www.boku.ac.at/oegbt/
Nationales Genomforschungsnetz
Corneliusstr. 6
D-80469 München
Tel.: +49-(0)-89-26024573
Fax: +49-(0)-89-26024574
info@vdbiol.de
www.vdbiol.de
c/o DLR – Koblenzerstr. 112
53177 Bonn-Bad Godesberg
Tel.: +49-(0)-228-3821-331
Fax: +49-(0)-228-3821-332
pm-ngfn@dlr.de
www.ngfn.de
Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik
Deutsche Gesellschaft für Genetik
c/o Institut für Humangenetik
Uni Gießen/Schlangenzahl 14
35392 Gießen
Tel.: +49-(0)-641-99-41600
Fax: +49-(0)-641-99-41609
www.med.uni-giessen.de
/genetik/dgng.html
c/o Genetisches Institut der
Universität Gießen
Heinrich-Buff-Ring 58-62
D-35392 Gießen
Tel.: +49-(0)-641-99-35463
Fax: +49-(0)-641-99-35469
www.gfgenetik.de
Netzwerk Nutrigenomforschung
Gesellschaft für Signaltransduktion
c/o Prof. Dr. Ralf Hass
Med. Hochschule Hannover
AG Biochemie u. Tumorbiol.
D-30625 Hannover
Tel.: +49-(0)-511-906-3649
Fax: +49-(0)-511-906-3433
www.sigtrans.de
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Arthur-Scheunert-Allee 114
14558 Bergholz-Rehbrücke
Tel.: +49-(0)-33200 88 385
Fax: + 49-(0)-33200 88 398
verein@nutrigenomik.de
www.nutrigenomik.de
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16.06.2004, 16:38 Uhr
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P R O D U K T W E L T
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Standardisierte cRNA-Target-Präparationen
Analyse von Genfunktionen
Mit Einführung des BioRobot Gene Expression Systems mit dem “GeneChip Target Preparation Specialist Pack” bringt QIAGEN
eine vollständig automatisierte Lösung für
Standard-Präparationen von cRNA-Targets
für Affymetrix® GeneChip® Arrays auf den
Markt. Dieses System automatisiert die Präparationsschritte von der Erststrang-cDNASynthese bis zur cRNA-Fagmentierung.
Bis zu 96 Proben – in Vielfachen von 8 –
können pro Durchlauf parallel verarbeitet
werden. Ausgehend von 5 µg Gesamt-RNA
als Matrize pro Probe, synthetisiert das BioRobot-System daraus zunächst die cDNA, anschließend die cRNA, welche dann fragmentiert wird. Das System ermöglicht cRNAAusbeuten von mehr als 20 µg bei Konzentrationen von mindestens 0,625 µg/µl. Die
cRNA-Ausbeuten sind rein, mit A260/A280Ratios größer als 1,8.
Das System besteht aus einer Robotik-Arbeitsstation, die über einen Roboterarm externe
Hardware integriert, die für die GeneChip
Target-Präparation benötigt werden. Das Gesamtsystem wird über einen Computer mit
dem QIAsoft 4.2-Betriebssystem und der
CLARA™-Software zur Ablaufplanung gesteuert. Geprüfte Software-Protokolle, die mit
dem „Specialist Pack“ ausgeliefert werden, ermöglichen einfachste Systembedienung und
reproduzierbare Probenverarbeitung.
TILLING (targeting induced local lesions in
genomes) ist eine moderne Methode zur genomweiten Identifizierung von Punktmutationen. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen darin, daß sie universell einsetzbar ist, sie ohne zeitaufwendige transgene
Schritte auskommt, Gene nicht nur komplett
sondern auch teilweise ausgeschaltet werden, und daß diese genetischen Veränderungen vererbbar sind. Eine schnelle und kostengünstige Variante zur Identifizierung von natürlichen Polymorphismen stellt das „Ecotilling“ dar.
Das Instrument der Wahl für TILLING &
Ecotilling ist das DNA Analysis-System von
LI-COR® Biosciences. Die besondere Eignung
stellt das System am Modellorganismus Arabidopsis unter Beweis: Pro Tag können bis zu
2.000 Proben und bis zu 2 Millionen Basen
zuverlässig gescreent werden.
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Nanoliter-Immunoassays
SNP-Detektions-Service
Biomagnetische Separationen
Mit Hilfe einer neuen Technologie der Firma
Gyros AB können unterschiedliche Laborapplikationen verkleinert, beschleunigt und integriert werden. In Gyrolab™-Mikrolaboratorien, in der Form einer Compact-Disk, erfolgt
die Analyse Hunderter von Proben parallel
und unter Kontrolle eines Vollautomaten, der
Gyrolab™-Workstation.
Das Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung weitet seine Dienstleistungen
rund um die GeneChip®-Technologie von
Affymetrix weiter aus. Als Affymetrix-Service-Provider bietet das RZPD die Analyse
des Human Mapping 10K-Arrays an.
Diese neuartige Array-Technologie zur
SNP-Detektion ermöglicht das parallele Screening von mehr als 11.500 SNPs auf einem einzigen Human Mapping 10K Array. Genomweite Analysen können innerhalb einer Woche durchgeführt werden. Lediglich geringe
Mengen Ausgangsmaterial werden benötigt.
Im Vergleich zu Mikrosatelliten-Analysen liefert das Verfahren wesentlich mehr genetische
Informationen. Die SNP-Array-Technologie
kann für Kopplungsanalysen, Assoziationsoder sogenannte „Loss-of-Heterozygosity
(LOH)“-Studien eingesetzt werden.
Die kürzlich auf der Analytica vorgestellte
Biomagnetic Workstation MCB-LH ist eine
Weiterentwicklung des bereits erfolgreich in
den Markt eingeführten MCB 1200. Sie erlaubt eine kostengünstige und einfach zu
handhabende Automatisierung von Magnetic-Beads-Applikationen für bis zu 12 Proben,
wie bei der DNA-Extraktion aus Blut oder Gewebe. Die Pipettierschritte wie Zugabe und
Absaugen der Pufferlösungen erfolgen mit
Hilfe eines automatischen Waschkamms. Das
System richtet sich an Anwender, die kleine
bis mittlere Probenaufkommen zu bewältigen
haben und nach einer effizienten Automatisierungslösung suchen.
Kapillar- und Zentrifugalkräfte bewegen Proben und Agenzien durch spezielle Mikrostrukturen, beispielsweise zum Aufbau von
Sandwich-Immunoassays an funktionalisierten Beads. Die Produktivität eines Labors läßt
sich im Vergleich zum Einsatz konventionellen Assays deutlich erhöhen. Lediglich Nanoliter-Mengen an Reagenzien und Probenmaterial sind notwendig, um Datenpunkte zu
generieren. Das flexible Assaydesign ermöglicht, Proteine nach Wunsch zu quantifizieren und eigene, für die jeweilige Anwendung
optimierte Reagenzien einzusetzen. Besondere Vorteile bietet die miniaturisierte und automatisierte Analyse, wenn Seren kleiner Versuchstiere wie von Mäusen untersucht werden sollen.
Neues „Proteomics RIMS“
Brukers Bioinformatik-Lösung “Proteomics
RIMS“ kombiniert und integriert Daten, Informationen und Ergebnisse, die in der Proteomik mit verschiedenen MS- und RöntgenKristallographie-Verfahren gewonnen wurden. Proteomics RIMS ermöglicht neue Erkenntnisse zu proteomischer Interaktion und
zu Strukturdaten, die von Oberflächenplasmonenresonanz-MS (in Zusammenarbeit mit
Biacore) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR, in Zusammenarbeit mit Bruker
BioSpin) geliefert werden. Es kombiniert ProteinScape™ und LIMS-Applikationen.
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50 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
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Neues Biomek® NX-System für mittleren Durchsatz
Neues Magtration® 8Lx
Mit der Biomek NX stellt Beckman Coulter
eine Laborautomations-Workstation der
nächsten Generation vor. Sie hat eine kompaktere Stellfläche als die komplexere Biomek
Precision System Science hat das Magtration®
System 8Lx präsentiert, ein neues 8-Kanal
Laborgerät zur vollautomatisierten HighYield genomischen DNA-Extraktion aus Vollblutproben, das Probenvolumen bis zu 10 ml
und ein Handlingsvolumen von bis zu 50 ml
beherrscht. Es verwendet die Magnetic-BeadsTechnologie, welche mittlerweile den de facto
Standard für hocheffiziente genomische DNAAufreinigung darstellt. Der typische DNA-Ertrag aus 7 ml Vollblut beträgt bis zu 150µg.
Das Magtration® System 8Lx ist eine echtes
„Walk-Away" Gerät unter der Verwendung
von vorbefüllten Reagenzien-Kits und einem
integrierten PC mit Touch-Screen-Display zur
einfachen Bedienung.
Aufgrund Barcode-gesteuerten Prozeßkontrolle und Automatisierung können menschliche Fehlbedienungen weitgehend ausgeschlossen werden. Weiterhin sind Cross-Kontaminationen durch diese Prozesstechnologie
auf ein Minimum reduziert. Am Ende eines
Prozessablaufs von etwa 50 Minuten Dauer
steht eine konzentrierte, aufgereinigte DNA
zur Verfügung, die direkt weiterverendet
werden kann.
FX und ist mit einer Acht-Sonden-Vorrichtung sowie einem Mehrkanalpipettierer für
Volumina bis 500 µl ausgestattet. Für maximale Flexibilität beim Platzieren und Entfernen von Laborinstrumenten kann das Span-
8-Gehäuse mit einem optionalen um 360°
drehbaren Greifer ausgerüstet werden. Die
Mehrkanal-Konfiguration wird mit 96er- und
384er- Pipettierköpfen angeboten.
Biomek NX arbeitet mit denselben Automated Labwere Positioners (ALP) wie das
Biomek FX-System. Ein optionales BarcodeLesegerät ermöglicht das Ablesen der Platten direkt während des Arbeitsvorgangs in
einem Schritt mit der Plattenbewegung.
Eine neue Koagulationserkennungsfunktion reagiert auf Fibrinkoagel und sorgt gegebenenfalls für eine Wiederholung des Dispensiervorgangs, während eine neue Membranperforationsfunktion die Probenahme aus
geschlossenen Röhrchen ermöglicht, wie
beim sogenannten „Closed-Tube-Sampling“.
Das System kann sowohl fest angebrachte als
auch Einwegspritzen verwenden. Biomek NX
arbeitet mit derselben Steuerungssoftware
wie Biomek FX und das ebenfalls neue Modell Biomek 3000.
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96-Well Polypropylen-Mikroplatten für die Real-Time PCR
Greiner Bio-One hat sein Angebot um optimierte Microplatten für Real-Time-PCR-Geräte ergänzt. Die neuen 96-Well PCR-Microplatten mit seitlichem Halbrand und seitlichen Aussparungen sind aus dünnwandigem,
mattiertem Polypropylen gefertigt und ermöglichen eine optimale Temperaturübertragung zwischen Thermoblock und Reaktionsgemisch. Durch die mattierte Oberfläche eignen sie sich besonders für Real-Time-Messun-
gen, da die Überstrahlung von Fluoreszenzsignalen minimiert wird. Verschlossen werden können die Microplatten mit speziellen
Real-Time-Deckelketten aus hochtransparentem Polypropylen, Standard-Deckelketten,
oder Abdeckfolien, wie zum Beispiel VIEWseal™ für die Real-Time PCR oder POWERseal™ und SILVERseal™. Die neuen RealTime-PCR-Microplatten sind, frei von DNasen, RNasen, humaner DNA und Pyrogenen.
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Hochempfindliche Tumorzellselektion und Analyse
Universeller Roboterarm
Das AdnaTest Cancer-System detektiert disseminierte Darm- und Brustkrebstumorzellen
in peripherem Blut mittels immunomagnetischer Zellselektion und Nachweis der tumorzellspezifischer Genexpression. Es kombiniert
eine effiziente Selektion/Anreicherung von
Tumorzellen mittels Antikörper-beschichteter
Magnetpartikel (AdnaTest CancerSelect) mit
anschließender molekularer Diagnose dieser
Zellen über eine Multiplex-RT-PCR (AdnaTest
CancerDetect).
Die einfach zu handhabenden AdnaTest
Cancer-Testsysteme ermöglichen eine hochempfindliche und schnelle Detektion disseminierter Tumorzellen im Blut. Die verwendeten Antikörper- und Primermixe sind spe-
Der Butler LB 930 von Berthold Technologies
ist ein universeller Roboterarm zur Handhabung von Mikroplatten. Seine Einsatzbereiche
reichen vom Beladen von Bertholds Mikroplatten-Leser bis hin zur Verwendung als zentrale Einheit einer Workstation für Anwendungen im Wirkstoffscreening, der Reformatierung von Mikroplatten, DNA-Isolierung und
PCR-Aufbereitung, Target-Identifizierung,
zellulären Assays sowie forensischen Diagnostik. Für Bertholds Mikroplatten-Leser stehen
vorbereitete Methoden zur Verfügung. Weitere
Einheiten wie Dispenser, Wascher und Inkubatoren können eingebunden werden. Das
System steht vorkonfiguriert für 20, 100 sowie
platzsparend für 100 Platten zur Verfügung.
ziell auf die jeweilige Tumore (Darm- und
Brustkrebs) abgestimmt. Durch die Kombination verschiedener Selektions- und Tumormarker werden sowohl der Heterogenität der
Tumorzellen als auch den möglichen individuellen oder therapiebedingten Schwankungen im Expressionsmuster Rechnung getragen. Die Nachweisempfindlichkeit der AdnaTest Cancer-Kits liegt bei 2 disseminierten
Tumorzellen pro 5 ml peripheres Blut. Das
AdnaTest Cancer ist den meisten Methoden
zum Nachweis von Krebs hinsichtlich der
Sensitivität deutlich überlegen. Somit ist eine
sehr viel frühere Detektion und Behandlung
von Krebs sowie ein besseres Monitoring der
Krebstherapie möglich.
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SCHOTT Nexterion Slide E für kovalente Sonden-Anbindung Neuer Quant-iT™-Assay
SCHOTT Nexterion hat in Zusammenarbeit
mit dem Microarray-Slide-Hersteller Duryea
seine Anwendungserfahrung ausgebaut und
stellt seine Kenntnisse Mikroarray-Anwendern zur Verfügung. Für Einsteiger steht außerdem ein Starter-Kit mit optimierten Reagenzien zum Spotten und Hybridisieren zur
Verfügung.
Die aktive Schicht aus reaktiven Epoxygruppen bindet alle nukleophilen Gruppen
der Sonden ohne UV-Crosslinking oder Reduktion sofort und irreversibel kovalent.
Eine Amino-Modifizierung der Oligonucleotide ist nur beim Spotten kurzer Oligos (≤25
Basen) erforderlich. Nexterion Slide E ermöglicht auch das Spotten von kleinen Spots und
somit hochdichter Microarrays mit gleichmäßiger und reproduzierbarer Spot-Morphologie. Die Beschichtung ist stabil und bleibt
auch bei langen Spotting-Prozessen reaktiv.
Für das Spotten von PCR-Produkten bietet SCHOTT Nexterion Slides mit Aminosilan- und Aldehyd-Oberflächen an. Besonders flexibel ist die Anwendung der Aminosilan-Slides Nexterion Slide A und Nexterion Slide A+. Auf diese Oberflächen können
unter Verwendung des gleichen Protokolls
PCR-Moleküle und auch längere Oligos (≥ 50
Basen) gespottet werden. Da beide Slide-Typen mit gängigen PCR-Protokollen funktionieren, können Anwender anderer Amino-
silan-Slides problemlos auf Slides von Schott
Nexterion umsteigen, ohne den Assay-Prozeß aufwendig neu optimieren zu müssen.
Alle beschichteten Slides von SCHOTT Nexterion sind aus einem speziellen Borosilikatglas gefertigt. Die geringe Eigenfluoreszenz
des Glassubstrats in Verbindung mit der homogenen Beschichtung der verschiedenen
Slidetypen ermöglicht eine ausgezeichnete
Analyseempfindlichkeit und gleichmäßige,
optimale Spots in Microarray-Experimenten.
Die neuen Quant-iT™-Assays von Molecular
Probes sind Quantifizierungssysteme für
DNA-, RNA- und Proteine. Die FluoreszenzKits sind jüngster Bestandteil der InvitrogenProduktpalette. Die Assays sind vielfach
empfindlicher als derzeitige UV-Absorbanzmethoden und benötigen lediglich 1 bis 20
Mikroliter Probenflüssigkeit. Das Quant-iT™
RNA-Assay-Kit ist der erste homogene Assay, der RNA in Gegenwart von DNA quantifizieren kann.
Quant-iT™ ist in drei Kits erhältlich: Für
kleine DNA-Mengen eignet sich das DNAAssay-Kit, High Sensitivity – etwa zur Quantifizierung von PCR-Produkten, viraler DNA
oder zu klonierender DNA-Fragmente. Konzentrierte Proben wie genomische DNA oder
Mini-Preps können mit dem DNA-Assay-Kit,
Broad Range ohne vorherige Verdünnung
verarbeitet werden. Für RNA steht das RNAAssay-Kit zur Verfügung – beispielsweise
zum Messen von Proben für Microarray-, RTPCR- und Northern-Blot-Analysen. Der
Quant-iT™ Protein-Assay-Kit ist ein einfach
durchzuführender Protein-Assay auf Fluoreszenzbasis. Häufig auftretende Verunreinigungen haben keinen Einfluß auf das Signal.
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Erweitertes Produktportfolio Epidermis-Modell EST-1000 ADME-Rationalisierung
Mit dem neuen Finnigan ProteomeX™ LTQ
ist erstmals eine integrierte Proteomics-Workstation kommerziell erhältlich. In dem System kommt ein neuer Hochleistungs-Proteomics-Autosampler, der Thermo Micro ASTM,
zum Einsatz. Eine Vielzahl von Säulen- und
Methoden-Kombinationen ermöglicht die
Anpassung an spezielle Applikationen wie
Protein-Mapping im Hochdurchsatz, maximaler Sequenzabdeckung, Mapping von
Phosphorylierungsstellen und der Multidimensional Protein Identification Technology
(MudPIT).
Eine spezielle, für Proteomics-Methoden
entwickelte Software ermöglicht die komplette Integration aller Komponenten und erlaubt
die Durchführung von intuitiven, automatisierten Programmläufen. Die neue vMALDI™-Ionenquelle ist ein voll integriertes intermediate-vacuum-MALDI-System für die Finnigan LTQ Linear Ion Trap. Die schnelle Data
Dependent™ MS/MS-Analyse von verdauten
Proteinen und Proteinmischungen kann in
einem einzigen Experiment durchgeführt
werden. Erstmals ermöglicht der vor kurzem
eingeführte Finnigan LTQ FT Hybrid FT-ICRMassenspektrometer die Routine FT-MS im
chromatographischen Zeitmaßstab.
Ein Epidermis-Modell von CellSystems® vereinfacht Hautverträglichkeitsuntersuchungen neuer Produkte. Der zelluläre Aufbau des EST-1000 entspricht dem der natürlichen Haut. Toxische und reizende Wirkungen können anhand von Multiparameteranalysen bestimmt werden. Es wird in laborüblichen 12-Well-Zellkulturschalen angeboten,
die eine einfache Applizierung der Substanzen auf die rekonstituierte Haut erlauben.
Schon mit AST-2000 (epidermalen Schichten auf einem korrespondierenden DermisÄquivalent) hat CellSystems® das erste kommerziell erhältliche Vollhautmodell eingeführt. Mit diesen Systemen bietet CellSystems®
Lösungen sowohl für die toxikologische Routineanalyse als auch für die Untersuchung der
komplexen Vorgänge bei der Hautirritation.
Ein beliebter Service bei ADME-Evaluierungsverfahren ist der Cloe-Screen. Für dieses Hochdurchsatz Verfahren zum Wirkstoffscreening bietet Millipore die MultiScreen
Caco-2 Assay-Platten an, um einen große Anzahl von Wirkstoffkandidaten schnell hinsichtlich der Permeabilität des Darmkanals
zu untersuchen. Hierbei ist Schnelligkeit entscheidend, um den steigenden Anforderungen immer aggressiverer Testzyklen zu entsprechen. Die Platte ist geeignet für steriles
Arbeiten und automatisierte Messungen der
permeabilität.
Im Vergleich zu Verfahren mit 24-Well-Platten bietet Millipores 96-Well-System Schnelligkeit, Effizienz und konstante Ergebnisse.
Das MultiScreen Caco-2 Assay-System wurde optimiert, um monomoleklulare Caco-2
Zellschichten von großer Integrität wachsen
zu lassen und mit Nährstoffen zu versorgen.
Es enthält die notwendigen Wachstumsplatten, Kulturplatte und die Platte für den Transport und die Analyse. Es ermöglicht das
Wachstum bis hin zur Analyse in ein- und
derselben Platte. Der Aufbau der innovativen
MultiScreen Caco-Platte ist für optimale Leistung auf verschiedenen Automationssystemen konzipiert.
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52 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
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16.06.2004, 14:17 Uhr
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Auch im Internet unter www.biocom.de
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Impressum
28.06.04: Biotechnologie im Brennpunkt:
Hochschulausbildung – am Bedarf vorbei?,
Frankfurt am Main
22.-26.08.04: CHISA 2004 – 16th International
Congress of Chemical und Process
Engineering, Prag
LABORWELT (ISSN 1611-0854)
erscheint zweimonatlich im Verlag der
Info: Ilona Schmidt, DECHEMA e.V. Frankfurt a. M.
(Tel.: +49-69-7564 254, Fax: +49-69-7564 304,
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29.06.04: 4. Fachtagung der Themenreihe
Pharma Diagnostics „Biobanking“, Regensburg
Info: Dr. Jens Reiter, Byern Innovativ GmbH
(Tel.: +49-911-20671 334, eMail: reiter@bayern-innovativ.de,
Web: www.forum-medtech-pharma.de/biobanking.htm)
01.-02.07.04: Technology Seminar „Novel
Technologies to Obtain and to Optimise the
Functionality of Proteins vom Milk, Whey and
Egg“, Weihenstephan
Druck
Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach
Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion
Biotechnologie, der Österreichischen
Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der
Gesellschaft für Genetik GfG, der Deutschen
Gesellschaft für Proteomforschung DGPF, des
Verbandes Deutscher Biologen vdbiol, der
Deutschen Gesellschaft für Neurogenetik
DGNG, der Gesellschaft für Signaltransduktion
STS, des Vereins zur Förderung der Nutrigenomforschung, der Biotechnologischen
Studenteninitiative e.V. (btS) sowie die
Wissenschaftler des Nationalen
Genomforschungsnetzes NGFN erhalten die
Zeitschrift im Rahmen ihrer Mitgliedschaft.
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unter www.biocom.de oder per Fax (siehe Seite
53) erforderlich.
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Info: Gerlinde Loebkens, TUHH-Technologie GmbH, Hamburg
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Web: www.tutech.de/veranstaltungen)
31.08.-03.09.04: Applications of Biocalorimetry
(ABC IV), Budapest, Hungary
Info: Birgit Weber, TU München (Tel.: +49-8616-714 205,
Fax: +49-8616-714 348, eMail: Birgit.Weber@wzw.tum.de,
Web: www.food-process-engineering.de)
01.07.04: 2. Niedersächsischer Life-Science-Tag,
Hannover
Info: MicroCal, Central Milton Keynes
(Tel.: +44-1908-309 490, Fax: +44-1908-309 499,
eMail: info@microcal.eu.com,
Web: www.microcalorimetry.com)
05.-09.09.04: EURADH 2004 – 7th European
Adhesion Conference, Freiburg i. Br.
Info: Annette van Ost, BioRegioN GmbH, Hannover
(Tel.: +49-511-9357 940, Fax: +49-511-9357 963,
eMail: annette.vanost@bioregion.de, Web: www.bioregion.de)
Info: Andrea Köhl, DECHEMA e.V., Frankfurt a. M.
(Tel.: +49-69-7564 235, Fax: +49-69-7564 441,
eMail: euradh2004@dechema.de,
Web: www.euradh.org)
02.-03.07.04: „Blaue Biotechnologie – unsere
Zukunft liegt im Meer“, Enkenbach
06.-08.09.04: 5th caesarium – Advances in
Biomedicine, Bonn
Info: Dr. Katrin Platzer, Ev. Akademie der Pfalz, Speyer
(Tel.: +49-6232-6020 0, Fax: +49-6232-6020 22,
eMail: eapfalz@t-online.de, Web: www.eapfalz.de)
Info: Center of advanced european studies and research, Bonn
(Tel.: +49-228-9656-102, Fax: +49-228-9656-111,
eMail: caesarium@lemmens.de,
Web: www.caesar.de/caesarium.0.html)
05.-06.07.04: Downstream-Processing,
Weihenstephan
Michaela Reblin
27.08.-01.09.04: Biocat 2004 – International
Congress on Biocatalysis, Hamburg
08.-11.09.04: ESBES-5 – 5th European
Symposium on Biochemical Engineering Science,
Stuttgart
Info: Bayern Innovativ GmbH (Tel.: +49-911-20671-350,
Fax: +49-911-20671-744,
eMail: baytech@bayern-innovativ.de,
Web: www.baytech.de)
Info: Beate Witteler-Neul, Kompetenznetz Verfahrenstechnik
Pro3 e.V. (Tel.: +49-711-6586 297, Fax: +49-711-6586 371,
Web: www.ibvt.uni-stuttgart.de/esbes-5/)
06.07.04: Pharmazeutisches Kolloquium –
Targets und Arzneistoffe der Zukunft, Greifswald
Info: Dr. Hans-Hartwig Otto, Institut für Pharmazie, Greifswald
(Tel.: +49-3834-864 875, eMail: ottohh@uni-greifswald.de,
Web: www.idw-online.de)
06.-07.07.04: Micro- and Nano-Technologies in
the Life Sciences, Zürich
Info: Hicham Abghay, Steinbeis-Europa-Zentrum Stuttgart
(Tel.: +49-711-123 4022, Fax: +49-711-123 4011,
eMail: abghay@steinbeis-europa.de,
Web: www.steinbeis-europa.de)
Info: Dr. Peter Welters, Phytowelt GmbH, Nettetal
(Tel.: +49-2162-778 59, Fax: +49-2162-892 15,
eMail: contact@abic2004.org, Web: www.abic2004.org)
14.-16.09.04: Nanofair 2004 – Nano Conference
2004, St. Gallen
Info: NMI - Natural and Medical Sciences Institute at the
University Tübingen (Tel.: +49-7121-515 30 0,
Fax: +49-7121-515 3016 , eMail: meameeting@nmi.de,
Web: www.nmi.de/meameeting2004/index.php)
Info: Olma Messen St. Gallen (Tel.: +41-71-2420 4444,
eMail: info@nanofair.ch, Web: www.nanofair.ch)
19.-21.09.04: Herbsttagung der Gesellschaft für
Biochemie und Molekularbiologie, Münster
th
07.-09.07.04: 6 International Conference on
Catalysis in Membrane Reactors 2004, Lahnstein
Info: Claudia Hermsdörfer, DECHEMA e.V., Frankfurt a. M.
(Tel.: +49-69-7564 295, Fax: +49-69-7564 304,
eMail: iccmr6@dechema.de, Web: www.dechema.de)
08.-09.07.04: 6th Fresenius Agro-Konferenz
„Behaviour of Pesticides in Air, Soils and Water –
Fate, Exposure and Regulatory Issues“, Köln
11.-14.07.04: 15th International Conference on
Arabidopsis Research, Berlin
Info: Isabell Witt, University of Potsdam
c/o Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
(Tel.: +49-331-5678 308, Fax: +49-331-5678 983 08,
eMail: witt@mpimp-golm.mpg.de,
Web: www.arabidopsis2004.de)
Info: Gerd Fuchs, Neue Messe GmbH, Rostock
(Tel.: +49-381-4051 514, Fax: +49-381-4051 515,
eMail: fuchs@neue-messe-rostock.de,
Web: www.neue-messe-rostock.de)
12.-15.09.04: ABIC 2004 – „AgBiotech goes
Europe“, Köln
06.-09.07.04: 4th Internationales Meeting –
Substrate-Integrated Micro Electrode Arrays
2004, Reutlingen
Info: Monika Stratmann, Akademie Fresenius GmbH
(Tel.: +49-231-7589 648, Fax: +49-231-7589 653,
eMail: mstratmann@akademie-fresenius.de,
Web: www.akademie-fresenius.de)
08.-10.09.04: BioCon Valley – Life Science for
the Future, Rostock
Info: GBM, Frankfurt am Main
(Tel.: +49-69-660 5670, Fax: +49-69-660 567 22,
eMail: info@gbm-online.de,
Web: www.gbm-online.de)
19.-22.09.04: Biocatalysis in the Food and Drinks
Industries, Stuttgart
Info: Universität Hohenheim, Stuttgart
(Tel.: +49-711-459 3407, Fax: +49-711-459 4267,
eMail: info@biocatalysis-hohenheim.de,
Web: www.biocatalysis-hohenheim.com)
19.-22.09.04: ICMP 2004 – 13. International
Conference on Pharmaceutical Medicine, Genf
Info: René Haller, MCI Suisse SA, Geneva
(Tel.: +41-22-339 96 26, Fax: +41-22-339 96 21,
eMail: rene.haller@mci-group.com,
Web: www.icpm2004.org)
LABORWELT
54 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004
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54
15.06.2004, 16:54 Uhr
왘

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