Vorlesung # 5 präsynaptische Mechanismen

Vorlesung # 5
präsynaptische Mechanismen,
Neurotransmitterfreisetzung
Alexander Gottschalk
Universität Frankfurt
SS 2010
Präsynaptische Organisation und Mechanismen
der Neurotransmitterfreisetzung
Neurotransmitter werden in diskreten Quanten freigesetzt (stimmt nicht ganz siehe "kiss-and-run"-Exozytose), entsprechend der Menge, die in einem
einzelnen synaptischen Vesikel enthalten ist
Neurotransmitter werden durch regulierte Fusion synaptischer Vesikel mit
der Plasmamembran freigesetzt
welche Mechanismen kommen dabei zum Tragen ?
welche spezialisierten Strukturen im präsynaptischen Terminal beeinflussen
die Freisetzung der Neurotransmitter ?
Freisetzung von Neurotransmittern erfolgt nach
Depolarisation des präsynaptischen Terminals …
elektrophysiologisch direkt messbar, z.B. in Riesensynapse des Tintenfisches:
Blockade prä- und postsynaptischer Na+-Kanäle mit TTX Æ kleinere EPSPs
Stimulating
… und ist vom Membranpotential abhängig,
jedoch nicht vom Na+- oder K+- Strom
and Na+
welches Ion trägt den präsynaptischen Einstrom ?
Æ Ca2+ ! Kanäle inaktivieren sehr
langsam; sichtbar, wenn
K+-Kanäle blockiert (durch TEA)
Blockade von Na+- und K+- Kanälen, prä-synaptische „Ladungsinjektion“ zur
Veränderung des prä-synaptischen Membranpotentials - Ca2+-Ionen involviert
Depolarisation des Nerventerminals führt zu Ca2+Einstrom – Nachweis über Fluoreszenzfarbstoff Fura-2
fura-2: Ca2+-sensitiver Farbstoff
Der Einstrom von Ca2+-Ionen löst die Fusion
synaptischer Vesikel mit der Plasmamembran aus
unter Spannungsklemme
und TTX-, TEA- Blockade
ist ein potentialabhängiger
Ca2+-Einstrom in das präsynaptische Terminal
messbar
Anstieg von [Ca2+] im
Terminal nur von ca. 100
auf 110 nM, jedoch ca.
1000fache Erhöhung der
Wahrscheinlichkeit für
Transmitterfreisetzung –
wie kann das sein ?
Der Einstrom von Ca2+-Ionen löst die Fusion
synaptischer Vesikel mit der Plasmamembran aus
unter Spannungsklemme
und TTX-, TEA- Blockade
ist ein potentialabhängiger
Ca2+-Einstrom in das präsynaptische Terminal
messbar
Anstieg von [Ca2+] im
Terminal nur von ca. 100
auf 110 nM, jedoch ca.
1000fache Erhöhung der
Wahrscheinlichkeit für
Transmitterfreisetzung –
wie kann das sein ?
Die Konzentration von Ca2+-Ionen im prä-synaptischen
Terminal ist rund um die Ca2+-Kanäle am grössten
Es bilden sich sog. „Ca2+Domänen“ hoher Ionenkonzentration, die ausreicht, die
Fusion synaptischer Vesikel
auszulösen.
Kooperativität des Ca2+
Sensors, bis zu 4 Bindungsstellen, erhöht Empfindlichkeit,
aber niedrige Affinität für Ca2+
1.8mM Ca++
direkt nach Öffnung der Ca2+-Kanäle
einige ms später, Ca2+ ist diffundiert
Prä-synaptische Ca2+-Kanäle befinden sich dort, wo
Neurotransmitter freigesetzt wird
Räumliche Organisation der neuromuskulären Synapse
Synaptische Vesikel an der
neuromuskulären Synapse
(in Xenopus)
Xenopus
„Band-“synapse
mit „Rippen“
Strukturen an
neuromuskulären
Synapsen von
Drosophila –
„T-Bars“
„Bruchpilot“ Protein;
STED Mikroskopie
Wildtyp
brp Mutante
Strukturen an
neuromuskulären
Synapsen von
Drosophila –
„T-Bars“
„Bruchpilot“ Protein;
STED Mikroskopie
Bruchpilot (homolog zu CAST/ERC
im Säuger) wichtig für die Lokalisation
prä-synaptischer Ca2+-Kanäle
an der aktiven Zone
Wildtyp
brp Mutante
Strukturen an
neuromuskulären
Synapsen von
Drosophila –
„T-Bars“
„Bruchpilot“ Protein;
STED Mikroskopie
Bruchpilot (homolog zu CAST/ERC
im Säuger) wichtig für die Lokalisation
prä-synaptischer Ca2+-Kanäle
an der aktiven Zone
Wildtyp
brp Mutante
Funktionelle Defekte bei der Vesikelfreisetzung
in brp-Mutanten
2 Gruppen von Vesikeln nachweisbar:
Gruppe I fusioniert schnell (ca. 2 ms)
Gruppe II fusioniert langsam (ca. 20 ms)
stimulierte Vesikelfusion
langsamer in brp-Mutanten
T-bars (Bruchpilot-Protein) könnten die effektive
Ca2+-Konzentration an der aktiven Zone erhöhen
T-BAR
SV
VGCC
wildtyp
VGCC
SV
VGCC
brp-
Prä-synaptische Dichte neuronaler Synapsen „particle web“
im Vergleich zu Neuromuskulärer Synapse kleine Aktive Zone, AP setzt nur
2-10 Vesikel frei; an der neuromuskulären Synapse kann ein AP bis zu
300 Vesikel zur Fusion anregen
Exozytose
synaptischer
Vesikel im EM
Synaptische Vesikel werden durch Endozytose
zurückgewonnen
Recycling von Vesikeln nötig,
damit Neuron stets in der Lage
ist, NT freizusetzen;
neuronales Terminal enthält ca.
200 SVs: Æ Bei hoher Aktivität,
z.B. 5 Hz, würde auch nur
1 Fusion pro Aktionspotential
SV Vorrat in 40 sec. depletieren
Der Lebenszyklus synaptischer Vesikel
Experimenteller Nachweis für (Endo- und)
Exozytose synaptischer Vesikel
Total internal reflection (TIRF) Mikroskopie erlaubt
die Beobachtung einzelner Fusionsereignisse
aus: Steyer & Almers (2001)
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2 268 pp
Zeit relativ zu präsynaptischer Reizung
3 µm
1 µm
Direkte Messung von Fusionsereignissen durch
patch clamp in Mastzellen und Neuronen
c) bipolares Retina Neuron – ca. 1000 SVs fusionieren
Messung der Fusion einzelner Vesikel
Durchmesser der
Fusionspore kann
aus Leitfähigkeit
errechnet werden,
diese abgeleitet
aus Zeitkonstante
des transienten
Stromes durch
die Pore
Vesikellumen
angesäuert, daher
meßbarer Strom von
Vesikel zu Plasmamembran, erhöht
durch Öffnung der
Fusionspore
Messung der Neurotransmitterfreisetzung
über Voltammetrie
Oxidation freigesetzter Aminneurotransmittern an der Kohlenstoff-Elektrode,
als Strom meßbar (A2), proportional zur Menge an freigesetztem Transmitter;
Membrankapazität/Membranstrom durch patch Elektrode gemessen (A1)
Verschiedene Arten der Vesikelrückgewinnung,
je nach Aktivität der Zelle
„Reserve Pool“: SVs, die
bei hoher Aktivität der
Synapse mobilisiert und
fusionskompetent gemacht
werden
„Readily releasable pool“:
SVs, die unmittelbar zur
Fusion zur Verfügung
stehen
bei normaler bis bei geringer
hoher Aktivität
Aktivität
bei sehr hoher
Aktivität
Ca2+ und GTP-abhängige Proteine regulieren
Vesikel-Budding, Mobilisierung und -Fusion
GDI – GDP dissociation inhibitor
GEF – Guanine nucleotide
exchange factor
GAP – GTPase activating Protein
GTP-Hydrolyse macht Vesikel-Docking / -Priming irreversibel
Wichtige Proteine, die an der Exozytose
synaptischer Vesikel beteiligt sind
SP
Spectrin, active zone
structural protein
Martin (2002)
Neuron 34, 1, 9-12
Synaptobrevin (V) v-SNARE
Synaptotagmin (Syt)Ca2+-sensor, trigger of fast fusion
Rab3
small G-protein, targets vesicle
to acceptor membrane
Syntaxin (Syx)
SNAP-25
t-SNARE, binds to Ca2+-Channel
r-SNARE
UNC-13 involved in priming, removes
UNC-18 from Syntaxin
UNC-18 regulates Syntaxin,
important for docking/priming
RIM
involved in priming and fusion,
effector of Rab3, could bind
vesicle to membrane
Proteine synaptischer Vesikel
Synapsin: bindet Vesikel an
Zytoskelett
v-ATPase: säuert Lumen an,
Protonengradient
treibt NT Transport
Transmitter Transporter beladen Vesikel mit NT
Synaptotagmin: Ca2+-Sensor
initiiert Fusion
Synaptobrevin: v-SNARE
Synaptophysin: nicht bekannt
Rab3: kleine GTPase, wichtig
für Membrantargeting
von SV, GTP Hydrolyse
macht dies irreversibel
SV2: nicht bekannt
Cystein string Protein: wichtig
für zuverlässige Kopplung
von AP und Vesikelfusion
Modell basierend auf
Proteomics und ProteinStoichiometrie Analyse
von gereinigten SVs
aus der Ratte
Jahn Labor,
MPI Göttingen, 2006
bzw. Volknandt &
Zimmermann
Uni FFM,
2005 - 2006
Modell basierend auf
Proteomics und ProteinStoichiometrie Analyse
von gereinigten SVs
aus der Ratte
Jahn Labor,
MPI Göttingen, 2006
bzw. Volknandt &
Zimmermann
Uni FFM,
2005 - 2006
Bildung des SNARE Komplexes bewirkt Fusion
von Vesikel- und Plasmamembran; bei SV
Recycling werden SNARE Komplexe gelöst
Synaptobrevin
SNAP-25
Syntaxin
SNARE: soluble N-ethyl-maleimide-sensitive factor (NSF) attachment protein receptor
Beispiel für molekulargenetische Studien in C. elegans: UNC-13
bewirkt Regulation von Syntaxin durch das Entfernen von UNC-18
“An open form of syntaxin bypasses the requirement for UNC-13 in vesicle priming”
stimulating
recording
Richmond et al. (2001) Nature 412, 338-341
stimulating
Co-Crystal Structure of Munc18 and Syntaxin Habc Domain
recording
Beispiel für molekulargenetische Studien in C. elegans: UNC-13
bewirkt Regulation von Syntaxin durch das Entfernen von UNC-18
“An open form of syntaxin bypasses the requirement for UNC-13 in vesicle priming”
stimulating
recording
Richmond et al. (2001) Nature 412, 338-341
Exozytose synaptischer Vesikel – Mechanismus
Rizo and Südhof (2002) Nat. Rev. Neurosci. 3, 641-53
Wie kann der SNARE-Komplex Membranen fusionieren ?
weitere
Proteine ?
Munc-18 ?
SNARE Komplex und Synaptotagmin
Chapman (2002) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3 1 pp
Synaptotagmin: Ca2+-Sensor, entweder positiver Regulator der Fusion,
oder negativer Regulator, der konstitutive Fusion verhindert
und durch Ca2+-Bindung „gehemmt“ wird;
bindet auch AP2 Clathrin Adapter während Endozytose
Funktionen von Synaptotagmin
Modell der Funktion von Synaptotagmin
Arac et al (2006) Nat Struct Mol Biol 13 209 pp
Zusammenwirken von Synaptotagmin und dem SNARE-Komplex - Modell
Zusammenwirken von Synaptotagmin und dem SNARE-Komplex - Modell
Zusammenwirken von Synaptotagmin und dem SNARE-Komplex - Modell
Neueres Modell für die
Funktion von Synaptotagmin
Martens, Kozlov, McMahon (2007) Science 316
Complexine verhindern Fusion von „super-primed“
Vesikeln, bis sie von Synaptotagmin entfernt werden
Syt
Munc18
SNAREs
Cxn
Complexine verhindern Fusion von „super-primed“
Vesikeln, bis sie von Synaptotagmin entfernt werden
Syt
Munc18
SNAREs
Cxn
Recycling von SNARE-Komplexen braucht ATP
SNARE recycling
Endophilin auch Enzym, reguliert
Membrankrümmung
Synaptojanin: PIP2-phosphatase
Lysophosphatidylsäureacyl-transferase (LPAAT)
Modell:
molekulare Vorgänge bei
Endozytose von SVs
Endophilin: Adapter für Dynamin, Synaptojanin
ChR2 in cholinergic & GABAergic motoneurons:
Æ Light-induced neurotransmitter release
hν
ChR2
hν
ChR2
Depolarization of
cholinergic neurons
Depolarization of
GABAergic neurons
Ö muscle contractions
Ö muscle relaxations
Automated behavioural analysis to parameterize synaptic function
collaboration with Greg Stephens
Princeton University
Synaptic vesicles recycling defects
uncovered by prolonged photo-stimulation
wild type
15 Hz sampling rate
Light-evoked behaviors in synaptojanin unc-26
and endophilin unc-57 mutants decrease during
prolonged illumination
Behavioral manifestation of SV recycling defect
Martin Brauner
ChR2-supported electrophysiological analysis
of synaptic transmission
JANA LIEWALD
recording electrode
ventral nerve cord
ChR2 in motor neurons
100 µm
200 pA
500 ms
2 Hz, 10 ms pulses
SV recycling defects in unc-26 mutants affects photo-ePSCs
Dynamin verdrillt Membran(schläuche) in vitro:
„spaltet“ knospende Vesikel von der Membran ab
Membran-“Tubules“, die mit Dynamin bedeckt sind
Æ Zugabe von GTP
Enden angehaftet
Enden frei
Synaptische Vesikel Fusion Zusammenfassung
MOVIE !