Genom-weite Screens zur systematischen Untersuchung

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Jahrbuch 2005/2006 | Buchholz, Frank; Kittler, Ralf; Putz, Gabriele; Pelletier, Laurence; Poser, Ina; Heninger,
Anne-Kristin; Drechsel, David; Fischer, Steffi; Konstantinova, Irena; Habermann, Bianca; Grabner, Hannes;
Yaspo, Marie-Laure; Himmelbauer, Heinz; Korn, Bernd; Neugebauer, Karla; Pisabarro, Maria Teresa | Genomw eite Screens zur systematischen Untersuchung elementarer biologischer Prozesse
Genom-weite Screens zur systematischen Untersuchung
elementarer biologischer Prozesse
Genome-wide Screens as a systematic approach to study key
mechanisms in biology
Buchholz, Frank; Kittler, Ralf; Putz, Gabriele; Pelletier, Laurence; Poser, Ina; Heninger, Anne-Kristin; Drechsel,
David; Fischer, Steffi; Konstantinova, Irena; Habermann, Bianca; Grabner, Hannes; Yaspo, Marie-Laure;
Himmelbauer, Heinz; Korn, Bernd; Neugebauer, Karla; Pisabarro, Maria Teresa
Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden
Korrespondierender Autor
E-Mail: buchholz@mpi-cbg.de
Zusammenfassung
Genom-w eite Screens sind für die moderne Biologie ein unerlässlicher Bestandteil einer erfolgreichen
Forschungsarbeit. Mit ihnen steht der W issenschaft ein außergew öhnliches Werkzeug zur Verfügung, um
systematisch die einzelnen Gene eines Genoms auf ihre Funktion bei allen elementaren biologischen
Prozessen in der Zelle zu untersuchen. Am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik (MPICBG) w urde ein Screening-Großprojekt aufgebaut, das diese neue Technologie als europäische Plattform
anbietet. Ein
erster Genom-w eiter esiRNA-Screen
der Arbeitsgruppe
von
Frank Buchholz
konnte
in
menschlichen Zellen Zellteilungs-Gene identifizieren. Die Ergebnisse sind speziell für die Krebsforschung von
Bedeutung, beruht doch diese Krankheit darauf, dass der Prozess der Zellteilung außer Kontrolle gerät. Das
MPI-CBG hat beim Aufbau des Screening-Großprojektes vor allem auf geeignete Partnerschaften gesetzt – Dr.
Ivan Baines, der am MPI-CBG für die Technologiekoordination zuständig ist, hat exzellente W issenschaft mit
starken Partnern aus der W irtschaft zusammengebracht und so ein neues Modell umgesetzt, das die
komplexen Fragestellungen der modernen Biologie angehen kann.
Summary
Genom-w ide screens are a major and significant part in modern biology. They provide a perfect tool to study
the function of various genes w ith clinical relevance and in key mechanisms in the cell. The Max Planck Institute
for molecular cell biology and genetics (MPI-CBG) has built up a Screening Facility that serves as a European
screening resource for the research community. An esiRNA screen in human cells performed by the research
group of Frank Buchholz has identified genes essential for cell division. Results like that have major clinical
relevance, and a medical implication especially for cancer research, since malfunctions of the mechanisms
underlying cell division are the cause for cancer. The MPI-CBG has found the right partners to build up this
screening project – Dr. Ivan Baines, Director of Services and Facilities at the MPI-CBG, brought together
expertise from the industry and excellent basic research to form a new model that is w ell-equipped to find
answ ers to the very complex questions in modern biology.
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft
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Forschung im postgenomischen Zeitalter
Als Gregor Johann Mendel Mitte des 19. Jahrhunderts in seinem Klostergarten mit Erbsen und Bohnen
experimentierte, hatte
er
noch
keine
Ahnung
von
der
Komplexität, die
die
von
ihm begründete
W issenschaftsdisziplin eines Tages haben w ürde. Heute ist das menschliche Genom sequenziert und Mendels
Nachfolger stehen vor der großen Aufgabe, die Funktionen von rund 30.000 Genen zu entschlüsseln – das
postgenomische Zeitalter ist angebrochen. Dabei hilft ihnen die so genannte RNA-interference-Methode (RNAiMethode), ein raffiniertes Werkzeug, um Genfunktionen in Genom-w eiten Screens herauszufinden. Sie
ermöglicht das gezielte Ausschalten von Genen und ist damit ein entscheidender Schritt zum Erkennen ihrer
Aufgaben.
Genom-w eite Screens sind für die moderne Biologie schon jetzt unerlässlicher Bestandteil einer erfolgreichen
Forschungsarbeit, und ihre Bedeutung w ird sich noch w eiter steigern. Mit ihnen steht der W issenschaft ein
außergew öhnliches Werkzeug zur Verfügung, um systematisch die einzelnen Gene eines Genoms auf ihre
Funktion bei allen elementaren biologischen Prozessen in der Zelle zu untersuchen. Genom-w eite Screens
verdanken ihre heutige Signifikanz vor allem der Sequenzierung des menschlichen Genoms oder anderer
Säugetiere w ie der Maus, w as zugleich eine ungemeine Bedeutung für die klinische Forschung mit sich bringt.
W ichtig für die Forschung ist auch die Entschlüsselung der Genome anderer in der Grundlagenforschung
etablierter Modellorganismen, w ie dem des Fadenw urms C. elegans, der Fruchtfliege Drosophila melanogaster,
des Kohlgew ächses Arabidopsis oder des Zebrafisches.
Neue Technologien w urden entw ickelt und sind mittlerw eile routiniert im Einsatz; sie ermöglichen eine w eitere
Ausw ertung der durch solche Sequenzanalysen ganzer Genome gew onnenen Informationen. Beispielsw eise
erlaubt es die RNA-interference (RNAi)-Methode, einzelne Gene in einem sequenzierten Genom auszuschalten
(knockout) oder w ahlw eise auch jedes beliebige sequenzierte Gen in einem noch nicht vollständig
entschlüsselten Genom eines Organismus, in dem diese Technik prinzipiell anw endbar ist. Eine w eitere Technik
ist das so genannte TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes), das quasi die Umkehrung der
RNAi-Methode darstellt: Im Gegensatz zur Knockout-Technik w erden beim TILLING nicht speziell Mutationen in
einem bestimmten Gen erzeugt, sondern aus einer Anzahl mutagenisierter Organismen gezielt diejenigen
gesucht, die Mutationen in einem gew ünschten Gen besitzen. Ursprünglich für Arabidopsis entw ickelt, ist
TILLING mittlerw eile auch für den Modellorganismus Zebrafisch eine etablierte Technik, und – w ie neueste
Ergebnisse zeigen – w ohl auch in naher Zukunft für Drosophila, C. elegans und die Maus einsetzbar. Die
Analyse von Genexpressionen, speziell im Zusammenhang mit DNA-Chips und Microarrays, ist ein ebenso
geeignetes Werkzeug, das auch in Organismen zum Einsatz kommen kann, deren Genom noch nicht
vollständig sequenziert ist, sofern eine EST-Bibliothek vorhanden ist.
Genome sind von einer ansehnlichen Größe, sie umfassen etw a 9.000 Gene in Hefe, beim Fadenw urm und der
Fruchtfliege ungefähr 20.000 Gene oder bis zu 35.000 Gene im Menschen und in der Maus. Um einen Genomw eiten Screen in einer akzeptablen Zeitspanne zu vervollständigen, bedarf es deshalb einer ausreichend
hohen Durchsatzleistung. Bisher w aren Durchlaufleistungen nur für Pharmakonzerne vor dem Hintergrund der
Medikamentenentw icklung von Interesse, w ährend sich W issenschaftler in der Grundlagenforschung mit
solchen Fragen nicht beschäftigten. Mittlerw eile w urden auch für den w issenschaftlichen Betrieb diese
Techniken
eingesetzt, um im postgenomischen
Zeitalter die
ungleich
komplexeren
Forschungsfragen
bearbeiten und beantw orten zu können. Dazu w urden Screens ebenfalls in solcher Weise automatisiert und
optimiert, dass die gew ünschte und benötigte Durchsatzleistung erzielt w erden kann.
Dazu kommt eine w eitere große Herausforderung: Solche Screens produzieren eine riesige Datenmenge, und
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Dazu kommt eine w eitere große Herausforderung: Solche Screens produzieren eine riesige Datenmenge, und
diese Daten müssen von höchster Qualität sein und von Anfang an generiert w erden, um eine hochkomplexe
und detaillierte Fragestellung zu beantw orten. Andernfalls w ürden alle Screenversuche der akademischen
Forschung im Ansatz stecken bleiben. Einzelne Versuchsanordnungen sind bezüglich der Physiologie oder
bestimmter biologischer Mechanismen nicht ausreichend aussagekräftig, insofern müssen ganze Sets von
kombinierten
Versuchsanordnungen
entw ickelt
w erden
(mit
einer
Durchsatzleistung
von
Tausenden
untersuchter Proben pro Tag), die dann brauchbare Daten und w ahre Einblicke in biologische Abläufe geben
können. Des Weiteren müssen die gew onnenen Daten auch deshalb in enormer Quantität generiert w erden,
um sie für w eitere Tests oder andere Techniken brauchbar zu machen, speziell, w enn solche Screens mit
einem vergleichenden Ansatz durchgeführt w erden. Dies beispielsw eise, um die biologischen Gegebenheiten
in normalen und krankhaften Systemen zu vergleichen.
esiRNA-Screen in menschlichen Zellen identifiziert Zellteilungs-Gene
Am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik w erden schon seit langem Genom-w eite
Screens durchgeführt, die nicht nur geholfen haben, die Screening-Technologie w eiterzuentw ickeln und zu
perfektionieren, sondern die auch immens w ichtige Daten für die Grundlagenforschung in der modernen
Zellbiologie bereitgestellt haben. Ein Beispiel: Die Arbeitsgruppe von Frank Buchholz hat die RNAi-Methode –
die bisher vor allem bei W irbellosen gute Ergebnisse erzielte – w eiterentw ickelt, um den Genen der Zellteilung
in Säugerzellen auf die Spur zu kommen. In mehreren aufeinanderfolgenden Screens ist es den Forschern
gelungen, 37 Gene herauszufischen, die für die Zellteilung eine Rolle spielen. Sieben davon w aren bisher nicht
charakterisiert. Ihre Methode des esiRNA-Screens erw eist sich damit als brauchbares Werkzeug beim Genomw eiten Aufspüren von Genfunktionen in Säugerzellen.
Um herauszufinden, an w elchen zellulären Prozessen ein bestimmtes Gen beteiligt ist, w ird genau dieses Gen
ausgeschaltet – gleichsam zum Schw eigen gebracht – und dann der Effekt beobachtet. Dabei hilft die RNAinterference-(RNAi)-Methode, die Funktion von bestimmten Genen zu identifizieren. Die Methode nutzt einen in
jeder
Zelle
ablaufenden
Mechanismus
–
der
ein
Genregulationssystem
und
gleichzeitig
einen
Abw ehrmechanismus darstellt: Die Zelle reagiert auf doppelsträngige RNA-Moleküle mit der sofortigen
Zerstörung des komplementären m-RNA-Abschnitts; ein Strang des RNA-Moleküls lagert sich an die passende
aktive m-RNA an und löst damit deren Abbau aus. Das Protein, für das die Nukleinsäure kodiert, kann nicht
entstehen. Zielgenau kann also mit diesen RNA-Molekülen ein Gen ausgeschaltet w erden.
Bei W irbeltieren müssen für diesen Vorgang kleinere doppelsträngige RNA-Abschnitte produziert w erden, so
genannte short interfering RNAs (siRNAs) von etw a 21 bis 30 Nukleotiden Länge. Größere RNA-Abschnitte
führen meist zu unspezifischen Reaktionen. Die Arbeitsgruppe um Buchholz hat deshalb aus 15.497
menschlichen Genen mithilfe eines Enzyms, der Endoribonuklease RNAseIII, entsprechend kleine RNA-Stücke
(esiRNA) produziert und sie zu einer Bibliothek zusammengestellt. Dieser Sammlung entnahmen sie 5.305
esiRNAs und suchten damit in HeLa-Zellen, einer speziellen Linie von Krebszellen, nach denjenigen Genen, die
die Zellteilung steuern oder beeinflussen (Abb. 1).
In einem ersten, robotergesteuerten Hochdurchsatz-Screen w urden 275 Kandidaten ausgew ählt, die mit der
Lebensfähigkeit der Zellen und so mit dem Prozess der Zellteilung in Verbindung zu bringen w aren. In einem
zw eiten Durchlauf w urden diese Gene dann erneut und diesmal mithilfe der Videomikroskopie im Detail
„durchgesiebt“ – anhand des entstehenden Erscheinungsbildes der Zellen konnten die Forscher feststellen,
ob sich ein ausgeschaltetes Gen auf das Funktionieren der Zellteilung ausgew irkt hat oder nicht. Übrig blieben
und identifiziert w urden nach diesem zw eiten Durchlauf 37 Gene, über die man nun sagen kann: Sie sind mit
verantw ortlich dafür, dass sich eine Zelle teilt.
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verantw ortlich dafür, dass sich eine Zelle teilt.
Die Funktion dieser 37 Gene w urde aber zunächst in der Forschungsliteratur und in einer Gen-Datenbank
überprüft. Tatsächlich w ar für sieben dieser Gene noch gar keine Funktion bekannt. Mit der neuartigen
Variante der esiRNA-Technologie konnten die Dresdner Forscher also sieben bisher uncharakterisierten Genen
eine Funktion zuw eisen – die Funktion „Zellteilung“. Unter den 37 selektierten Genen w aren unter anderem
Splicing-Faktoren, deren Knockdow n zu Defekten der Zellteilungsspindel führten. Interessant auch die
Entdeckung eines Gens, das den Prozess der Zellteilung beschleunigt und dabei auch die Morphologie der
Zellteilung verändert.
All diese Ergebnisse sind für die Krebsforschung von Bedeutung, beruht doch diese Krankheit darauf, dass der
Prozess der Zellteilung außer Kontrolle gerät. Zudem haben die W issenschaftler mit ihrer Versuchsreihe
bew iesen, dass ihre esiRNA-Methode ein brauchbares Werkzeug für Genom-w eite Screens in Säugetierzellen
darstellt: Sie ist effizient, schaltet zuverlässig und sehr zielsicher die gew ünschten Gene aus und kann leicht
verschiedenen Versuchsanordnungen angepasst w erden.
Die P hä notype n von Ze llte ilungsde fe k te n in He La -Ze lle n. Bla u
e inge fä rbt ist die DNA, Tubulin ist rot m a rk ie rt zu se he n. Die
De fe k te , die a us de m Ausscha lte n de r im Folge nde n
a ufge führte n m e sse nge r-R NAs re sultie re n, sind de utlich zu
se he n: KIF11 (b), DDX48 (c), SNW 1 (d, l), DHX8 (e , k ), MFAP 1
(f) DKFZP 564M082 (g) FLJ30851 (h) und im portin-β (i). Die
P fe ile in de n Abbildunge n (j) und (k ) ze ige n die P osition de r
Ze llte ilungsfurche a n. De r P fe il in de r Abbildung (l) de ute t a uf
de n zusa m m e nge fa lle ne n Zytopla ste n.
© Ma x -P la nck -Institut für m ole k ula re Ze llbiologie und
Ge ne tik /Arbe itsgruppe Buchholz
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Screening als europäische Plattform
Das MPI-CBG hat sich beim Aufbau des Screening-Großprojektes vor allem von der Erkenntnis leiten lassen,
dass moderne akademische Forschung bei solch komplexen Fragestellungen nicht mehr isoliert arbeiten kann,
sondern nur geeignete Partnerschaften zum Erfolg führen können: „Es bedarf nicht nur exzellenter
W issenschaft, sondern auch starker Partner aus der Industrie und innovativer, kreativer Finanzierungsmodelle
für eine solche Aufgabe, die nicht nur eine große w issenschaftliche, sondern auch eine finanzielle
Herausforderung ist“, so Ivan Baines, der als „Director of Services and Facilities“ am MPI-CBG für die
Technologiekoordination zuständig ist. Mit seinen früheren Erfahrungen als Berater bei Lizenzvergaben und
als
Entw ickler
neuer
Geschäftsmodelle
hat
er
dazu
den
nötigen
Background:
„Die
derzeitigen
Forschungsaufgaben in der Zellbiologie sind vor allem unglaublich teuer – sie übersteigen das Budget einer
akademischen Forschungsinstitution. Für die neuen Technologien und neuartigen Aufgaben brauchten w ir also
auch neue Modelle der Umsetzung“, so Baines. Die derzeitigen Forschungserfolge w urden also auch und
gerade durch eine gut funktionierende Zusammenarbeit mit Partnern aus der W irtschaft erzielt. Spezielles
Know -how zur RNAi-Technik beispielsw eise w urde von der Cenix BioScience GmbH beigesteuert, einem StartUp-Unternehmen, das aus dem MPI-CBG hervorgegangen ist (sow ie dem European Molecular Biology
Laboratory, Sanger und BCCA). In einer w eiteren interdisziplinären Projektkooperation w urde beispielsw eise
eine in der Entw icklung befindliche Bildanalyse-Softw are der Definiens AG im w issenschaftlichen Betrieb des
MPI-CBG von den Forschern evaluiert. Auch mit der Evotec Technologies GmbH, die führend auf dem Gebiet des
Ultra-Hochdurchsatz-Screenings und der Zellanalysatoren-Technologie ist, besteht eine solche Kooperation.
Mit diesem Modell, das W irtschaft und W issenschaft als starken Verbund nutzt, kann garantiert w erden, dass
die Screening-Einheit des MPI-CBG stets auf dem neuesten Stand der Technik ist und auch im Bereich der
Technologieentw icklung der Input aus der angew andten Forschung in die Industrie gegeben w erden kann.
Das Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik hat in den durchgeführten biologischen
Screens eine Vielzahl an technologischen Unterbereichen ausgebaut und in ihrer Exzellenz verfeinert. Die
Einrichtung
des
Screening-Großprojektes
stand
von
Anfang
an
unter den
folgenden
Zielsetzungen:
Ausw eitung des technischen Know -how s für die Planung und Durchführung von automatisierten Workflow s für
Hochdurchsatz-Screens,
Anreicherung
der
fachlichen
Kompetenz
für
das
Entw ickeln
grundlegender
Versuchsanordnungen und deren Optimierung für den Hochdurchsatz, Aufbau einer Datenbank für Assays, die
grundlegende Mechanismen der Biologie und Krankheitsbilder simulieren („Total Mechanism in Biology
Simulation” TMBS und „Total Disease Indication Simulation” TDIS), Pilot-Screens, basierend auf Techniken w ie
RNAi, Expressionanalyse oder TILLING. Zudem ist es erklärtes Ziel, das Screening-Projekt zu einem
europäischem Screening-Center, einer
Plattform von
europäischer
Bedeutung
für
Genom-w eite
und
zellbasierte Screens, auszubauen, und den Technologietransfer voranzutreiben, um erlangtes W issen und
Ergebnisse der Grundlagenforschung in Anw endungen, Produkte und Start-Ups im kommerziellen BiotechBereich zu überführen.
Das MPI-CBG hat mit seinen 24 Forschungsgruppen und rund 400 Mitarbeitern im täglichen Forschungsbetrieb
einen großen Bedarf an Genom-w eiten Screens, um systematisch die einzelnen Gene eines Genoms auf ihre
Funktion bei allen elementaren biologischen Prozessen in der Zelle zu untersuchen. Die bereits durchgeführten
Pilotprojekte im Bereich des Genomic Screenings haben gezeigt, dass mit solch einem Modell eine Plattform
von europäischer Ausstrahlung geschaffen w erden konnte, die der Grundlagenforschung die nötigen
Arbeitsmittel an die Hand gibt und zugleich beim Generieren dieser eminent w ichtigen Daten und Erkenntnisse
auch den Grundstock für w eitere Technologieentw icklungen bietet.
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