Interfacial rheology and processing of amyloid fibrils and bacterial biofilms

Interfacial rheology and processing of amyloid fibrils and bacterial biofilms

Dissertation ETH number 22068
Interfacial rheology and processing of amyloid
fibrils and bacterial biofilms
A dissertation submitted to
ETH Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Patrick Alberto Rühs
MSc ETH in Food Science
born 10th April 1985
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. E. J. Windhab, Examiner
Prof. Dr. P. Fischer, Co-Examiner
Prof. Dr. R. Mezzenga, Co-Examiner
2014
Summary
In soft fluid systems, such as emulsions and foams, the interface between two phases
can be stabilized through surfactants, particles, bacteria, and proteins. One protein
of high interest to the food industry is β-lactoglobulin. β-lactoglobulin fibrils, formed
through denaturation of β-lactoglobulin, are linear semi-flexible fibrillar aggregates
and show isotropic-nematic phase transitions in bulk at remarkably low concentrations. So far, the surface activity and thus the isotropic nematic phase transition at
the interface is unknown. To measure the surface activity at various interfaces, the
fibrils were measured through dilatational or by interfacial shear rheology.
The dilatational response of β-lactoglobulin fibrils and native β-lactoglobulin at
water-air and water-oil (pH 2) was measured using the pendant drop method. The
resulting adsorption behavior and viscoelasticity is dependent of concentration and
adsorption time. The transient saturation of the interface is similar for both the fibril
solution and the monomers, however the fibril solution forms a strong viscoelastic
network. The sinusoidal oscillations (time depended area deformation rate) results
in a complex interfacial tension behavior against air and oil interfaces and show remarkable differences during compression and expansion as emphasized by Lissajous
figure displaying the influence of protein adsorption during rheological measurements.
Additionally, a shear rheometer with a bicone geometry set up was modified to allow subphase exchange without disrupting the interface, enabling the investigation of
rheological properties after adsorption of the fibrils, as a function of time, different
pH, and ionic strength conditions. It was shown that an increase in pH (2 to 6)
leads to an increase of both the interfacial storage and loss moduli. At the isoelectric
point (pH 5-6) of β-lactoglobulin fibrils the maximum storage and loss moduli are
reached. Amplitude sweeps at different pH reveal a weak strain overshoot around the
isoelectric point whereas with increasing ionic strength, the moduli increase without
a strain overshoot.
By combining both methods and through exploration of the linear and non-linear
regime, the complex interfacial viscoelastic layers formed by β-lactoglobulin fibrils,
β-lactoglobulin peptides, and native β-lactoglobulin at the water-oil interface at pH
2-12 were analyzed. The fibril and peptide solution presented a similar surface density whereas β-lactoglobulin monomers lower the interfacial tension more efficiently.
The interfacial tension/dilatational rheology response to drop area amplitude sweeps
xii
Summary
showed pronounced differences, as the β-lactoglobulin fibrils and monomer react nonlinear at high frequencies and area strains, an effect not observed for β-lactoglobulin
peptides. Step strain experiments in combination with frequency sweeps presented
the material response. The observed dilatational rheological responses can be described using two different adsorption models, the Maxwell model and a modified
Lucassen and van den Tempel (LVDT) model. A large amplitude oscillatory shear
(LAOS) analysis in combination with subphase pH changes showed strain stiffening
occurring at the isoeletric point, which was quantified by the strain stiffening index
S.
To test the developed methods on amyloid fibrils in a biological system, biofilms
formed at water-air and water-oil interfaces were studied with interfacial rheology.
By culturing a range of bacterial biofilms at both interfaces, the viscoelastic growth
profile during and after biofilm formation could be observed. Different bacterial species had unique viscoelastic growth profiles, which were also highly dependent on the
growth media used. Additionally, biofilm formation could be reduced by the addition of surfactants and changes in pH, thereby altering the viscoelastic properties
of the biofilm. The initial kinetics of bacterial attachment at the water-oil interface
were observed through interfacial rheology and tensiometry. To validate interfacial
rheology and tensiometry measurements, the biofilm formation was monitored utilizing both confocal laser scanning microscopy and light microscopy. The bacteria were
also characterized with electrophoretic mobility measurements and bacterial adhesion
to hydrocarbons (BATH) tests. Using this combination of techniques, the elasticity
and tension development over time, from the first bacterial attachment up to biofilm
formation was observed.
In summary, the construction of a subphase exchange cell in both, tensiometry and
rheology, allowed to observe the effect of environmental factors on the interfacial
elasticity and viscosity over time. Furthermore, by observing changes in the nonlinear
regime, systems which displayed no characteristic differences in the linear regime could
be differentiated. With this toolbox, complex interfaces were accurately measured and
complex interfaces such as protein adsorption layers and biofilm formation at waterair and water-oil interfaces with changing environmental conditions were understood.
The methods developed in this thesis will allow a broader understanding of complex
adsorption layers over time.
xiii
Zusammenfassung
Die Grenzfläche zwischen zwei Phasen kann in weichen Materialien wie Schäumen
oder Emulsionen durch Tenside, Partikel, Bakterien oder Proteine stabilisiert werden.
Ein oberflächenaktives Protein von höchstem Interesse für die Lebensmittelindustrie
ist β-lactoglobulin. Durch dessen Denaturierung, zum Beispiel durch Hitze oder saure
Bedingungen, können langkettige halbflexible Proteinaggregate entstehen, welche bei
sehr niedrigen Konzentrationen isotropische-nematische Phasenübergänge aufweisen.
In dieser Arbeit wurde die Grenzflächenrheologie von β-lactoglobulin-Fibrillen untersucht um die bisher unbekannte Grenzflächenaktivität von Fibrillen zu messen.
Die Dilatationsrheologie von β-lactoglobulin-Fibrillen und nativem, nicht denaturierten β-lactoglobulin an Wasser-Luft und Wasser-Öl-Grenzflächen wurde mit der
Hängenden-Tropf-Methode gemessen. Daraus resultierende Adsorptions- und Viskoelastizitätsverhalten sind abhängig von der Proteinkonzentration und der Adsorptionszeit. Die Sättigungszeit der Grenzfläche ist ähnlich für beide Proteinsysteme.
Somit sind auch die Grenzflächenspannungen gleich, wobei in Oszillationsmessungen
stärkere Netzwerke der β-lactoglobulin-Fibrillen beobachtet wurden. Unter Kompression und Expansion der Fläche zeigt die Grenzflächenspannung ein komplexes Verhalten. Diese nicht-Linearitäten wurden durch Lissajous-Graphiken aufgezeigt und
konnten dadurch charakterisiert werden.
Zusätzlich wurde der Aufbau des Grenzflächenrheometers modifiziert, um während
der Messung simultan die untere Phase kontrollieren zu können. Diese neue Konstruktion erlaubt es während der Messung die pH und Ionenstärke kontrolliert zu
verändern. Es wurde gezeigt, dass ein Anstieg von pH 2 auf pH 6 eine Vergrösserung der Elastizitäts- und Viskositätsmodule bewirkt. Am Isoelektrischen Punkt der
β-lactoglobulin-Fibrillen wurden die höchsten Elastizitäts- und Viskositätsmodule gemessen. Durch erhöhte Interaktionen am Isoelektrischen Punkt verlieren die Proteine
ihre Abstossung und aggregieren. Dies hat eine Erhöhung beider Module zur Folge.
Durch eine Erhöhung der Scherdeformation bei konstanter Frequenz wurde ein Anstieg des Viskositätsmoduls bei höherem pH beobachtet, was ein Hinweis auf eine
Gelierung der Proteine an der Grenzfläche ist.
Durch die Kombination von beiden Methoden und durch Messungen im nicht-linearen
Grenzflächenbereich wurden die Systeme β-lactoglobulin-Fibrillen, natives β-lactoglobulin und β-lactoglobulin-Peptidfragmente bei pH 2-12 untersucht. Die Fibril-
xiv
Zusammenfassung
len und Peptidfragmente konnten im gleichen Ausmass die Grenzflächenspannung
herabsetzen wohingegen das native β-lactoglobulin die Grenzflächenspannung stärker herabsetzte. Die Grenzflächenspannung und Dilatationsrheologie von Fibrillen
und nativem β-lactoglobulin zeigten starke Unterschiede im nicht-linearen Bereich
bei hohen Flächenänderungen. Dieser Effekt konnte nicht beobachtet werden bei βlactoglobulin-Peptiden. Mittels Frequenz- und Deformationsversuche wurde das Material charakterisiert. Das elastische Verhalten wurde durch zwei Modelle (Lucassen
und van den Tempel Modell, Maxwell Modell) beschrieben. Grosse Scherdeformationen in Kombination mit pH-Subphasenaustauschversuchen zeigten ein scherverdickendes Verhalten am Isoelektrischen Punkt. Das Verhalten wurde zusätzlich charakterisiert durch die Berechnung des Scherverdickungsindex S.
Um die ausgearbeiteten Methoden an einem realen biologischen System anzuwenden, wurden bakterielle Biofilme an Wasser-Luft- und Wasser-Öl-Grenzflächen durch
Grenzflächenrheologie gemessen. Durch die Messung einer Vielzahl von Bakterien
an beiden Grenzflächen wurde die Elastizitätsentwicklung durch Adhäsion von Bakterienstämme und Biofilm-Bildung über die Zeit gemessen. Jede getestete Bakterienart wies einzigartige Elastiztitätsprofile über die Zeit auf. Zusätzlich konnte die
Biofilm-Bildung während den Messungen beeinflusst werden durch die Zugabe von
grenzflächenaktiven Substanzen und durch Änderungen des pH. Die Biofilm-Bildung
wurde auch mit konfokaler Lasermikroskopie und Lichtmikroskopie beobachtet. Die
Bakterien wurden charakterisiert durch Elektrophorese und Testen der Adhäsion an
hydrophobe Flüssigkeiten (BATH). Die Kombination der verschiedenen Methoden
ermöglichte eine Beobachtung der Elastizität und der Grenzflächenspannung von der
ersten bakteriellen Adhäsion an der Grenzfläche bis zur Biofilm-Bildung.
Durch die Möglichkeit einen Austausch der Subphase während der Messung vorzunehmen, konnten Effekte von Umwelteinflüssen auf die Elastizität und Viskosität
gemessen werden. Ausserdem konnten Unterschiede beobachtet werden in Systemen,
die im linearen Bereich nicht voneinander zu unterscheiden waren. Mit diesen Methoden war es möglich, komplexe Grenzflächen wie Protein-Adsorptionsschichten und
Biofilm-Bildung zu untersuchen.
xv