Skript Teil 1, Lange

MB 02
Grundlagen der Biochemie der Pflanzen
ZEITPLAN
Mo
3.2.1 Induktion der -Amylase-Synthese:
Ansetzen der sterilen Lösungen, autoklavieren
Präparation der Gerstensamen (Schritt 1)
Sterilisation der Samen und Induktion der -Amylase (Schritte 2-4)
2.1.1 Herstellung der Blattextrakte
2.1.2 Auftrennung der Blattpigmente durch Dünnschichtchromatographie
2.1.3 Identifizierung der Blattpigmente durch Spektrophotometrie
Di
3.1.1 Mikro-Isolation von genomischer DNA
3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.2.2 -Amylase Extraktion, Enzymtest und Eichgerade
3.1.3 Gel für Agarose-Gelelektrophorese (Mittwoch) herstellen
Mi
3.1.3 Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese
2.2
Einfluss des pH-Wertes auf die Farbe von Anthocyan und Betacyan
http://www.ifp.tu-bs.de
MB02-2015-1
2
Inhalt
1
ALLGEMEINE ANMERKUNGEN ................................................................................................ 3
2
PFLANZENPIGMENTE, CHROMATOGRAPHIE, SPEKTROPHOTOMETRIE ............. 4
2.1
PLASTIDENFARBSTOFFE (CHLOROPHYLLE UND CAROTINOIDE) ...................................................................................... 4
2.1.1
Herstellung der Blattextrakte ............................................................................................................................ 4
2.1.2
Auftrennung der Blattpigmente durch Dünnschichtchromatographie ....................................................... 4
2.1.3
Identifizierung der Blattpigmente durch Spektrophotometrie .................................................................. 6
2.2
EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE FARBE VON ANTHOCYAN UND BETACYAN ........................................................... 7
3
AMYLASE: GENE, ENZYMAKTIVITÄT, PCR, ELEKTROPHORESE ....................... 8
3.1
NACHWEIS VON AMYLASE GENEN IN GERSTENKEIMLINGEN .................................................................................... 8
3.1.1
Mikro-Isolation von genomischer DNA .............................................................................................................. 8
3.1.2
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ....................................................................................................................... 9
3.1.3
Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................... 11
3.2
GIBBERELLINSÄURE INDUZIERTE AMYLASE EXPRESSION IM GETREIDEENDOSPERM ............................................ 12
3.2.1
Induktion der Amylase-Synthese ................................................................................................................. 12
3.2.2
Amylase Extraktion, Enzymtests, und Eichgeraden ................................................................................. 13
3
1 Allgemeine Anmerkungen
Protokolle:
Während der nachfolgenden Versuche dokumentieren Sie bitte ihre Versuchsdaten in Protokollheften (nicht auf losen Zetteln). Notieren Sie das Datum des
Versuchs. Das auf diesen Versuchsdaten basierende Protokoll sollten Sie entsprechend international üblichen Standards für Publikationen gliedern, d.h.:
1. Einleitung:
Geben sie kurz die Fragestellung sowie die Intention des Versuch wieder.
2. Material und Methoden:
Beschreiben Sie hier das verwendete Versuchsobjekt und eventuelle Veränderungen, die ihre Versuchsdurchführung von der im Skript beschriebenen unterscheidet. Komplizierte Versuchsaufbauten können graphisch dargestellt werden. Kopieren Sie bitte nicht das Skript!
3. Ergebnisse:
In diesem Kapitel beschreiben Sie kurz die erzielten Ergebnisse. Vermeiden
Sie Interpretationen! Sie sollten Ihre Ergebnisse graphisch oder in Tabellenform übersichtlich darstellen. Beachten Sie bitte: Jede Abbildung sollte eine
Unterschrift und jede Tabelle eine Überschrift besitzen, aus der die vorgestellten Daten verständlich werden. Bei graphischer Darstellung beachten Sie bitte,
dass Kurvenpunkte deutlich erkennbar (Durchmesser ca. 3 mm) und eindeutig
voneinander unterscheidbar sein müssen (z.B. ●---●; ■---■). Die Achsen müssen eindeutig beschriftet sein (z.B. Konzentration [M] oder Zeit [min]).
4. Diskussion:
Hier interpretieren Sie ihre Ergebnisse und setzen sie in Bezug zu den aus der
Literatur bekannten Resultaten. Mögliche Ursachen für Fehlerquellen können
diskutiert werden.
5. Literatur:
Die unter 1.-4. aufgeführten Literaturzitate werden wie folgt angegeben:
Autoren (Erscheinungsjahr), Titel der Veröffentlichung, Zeitschrift, Band, Seitenangaben, z.B.:
Schopfer P, Brennicke A (1999) Pflanzenphysiologie, 4. Aufl. Springer BerlinHeidelberg-New York
Steward FC, Mapes MO, Kent AE, Holsten RD (1964) Growth and development of cultured plant cells. Science 143, 20-27
Wichtig! Protokolle mit Datum und den Namen aller Gruppenmitglieder sind
nach dem Versuchende abzugeben. Korrekturen müssen spätestens 2 Wochen
nach Versuchende abgegeben werden.
4
2 Pflanzenpigmente, Chromatographie,
Spektrophotometrie
In diesem Teil werden Ihnen Chemie und Eigenschaften der wichtigsten Pflanzenpigmentgruppen (Anthocyane, Betalaine, Chlorophylle, Carotinoide) vorgestellt und Sie werden mit den weithin verwendeten Methoden der Lösungsmittelextraktion, Chromatographie und Spektrophotometrie vertraut gemacht.
2.1 Plastidenfarbstoffe (Chlorophylle und Carotinoide)
Dieser Versuchsteil befasst sich mit den pflanzlichen Pigmenten, die in den
Plastiden vorliegen. Grundsätzlich werden die Chlorophylle (grün bis blau)
von den Carotinoiden (rot, orange, gelb) unterschieden. Letztere werden aufgrund ihrer chemischen Struktur in Carotine (rot, orange) und deren sauerstoffhaltige Derivate, die Xanthophylle (orange, gelb), untergliedert.
Diese Pigmente werden aus Blättern extrahiert (2.3.1), dünnschichtchromatographisch getrennt (2.3.2) und spektrophotometrisch mit einem automatisch
registrierenden Spektralphotometer identifiziert (2.3.3).
2.1.1
Pflanzenmaterial:
Herstellung der Blattextrakte
3 g voll entwickelte Blätter einer beliebigen Pflanze (Pflanzenmaterial selber
besorgen!)
Anmerkung: Junge Blätter sind reicher an Lipiden, die bei der Chromatographie stören, ebenso ist Löwenzahn ungeeignet. Besonders geeignet sind voll
entwickelte Blätter von Brennnessel, Spinat oder Blutbuche.
Reagenzien:
Aceton,
Petroleumbenzin (Sdp. 40-60°C),
CaCO3,
NaCl,
Seesand
Equipment:
Mörser mit Pistill,
Schere,
Tischzentrifuge,
Pasteurpipetten
Durchführung:
1. Etwa 3 g Blattmaterial zerschneiden und in einem Mörser (auf Eis) mit einem gehäuften Spatel CaCO3 und einer Spatelspitze Seesand gründlich zerreiben. Allmählich ca. 10 mL eiskaltes Aceton zusetzen, dabei weiter mörsern,
bis sich ein tiefgrüner einheitlicher Brei gebildet hat.
2. Den Extrakt in Zentrifugenröhrchen überführen. Mörser mit 2 mL Aceton
ausspülen. Röhrchen in der Tischzentrifuge (gegenüberliegende Gläser austarieren!) zentrifugieren: 5 min, 4000 rpm. Überstand abheben, in ein sauberes
Reagenzglas transferieren und im Eisbad aufbewahren. Pellet verwerfen.
Anmerkung: Um Photooxidation insbesondere der Chlorophylle zu vermeiden,
sollten die Extrakte möglichst kühl und dunkel gehalten werden.
2.1.2
Reagenzien:
Auftrennung der Blattpigmente durch Dünnschichtchromatographie
Propanol-2,
Petroleumbenzin (Sdp. 40-60°C),
Aceton,
Ethanol.
5
Equipment:
Pasteurpipetten,
Spatel,
Zentrifugengläser,
Chromatographiekammer (klein),
Dünnschicht-Fertigplatte (Kieselgel 60 auf Aluminium).
Durchführung:
1. Herstellung des Fliessmittels (für zwei Gruppen ausreichend):
1 mL Propanol-2 werden mit 0,025 mL H2Obidest. in einem 100 mL Erlenmeyerkolben gründlich gemischt. Dann werden 10 mL Petroleumbenzin (Sdp. 4060°C) zugefügt und das fertige Fliessmittel in eine kleine Chromatographiekammer gegeben.
Anmerkung: Für eine gute chromatographische Trennung sollte die Atmosphäre laufmittelgesättigt sein. Um dies zu beschleunigen, wird das Laufmittel im
geschlossenen DC-Tank geschwenkt.
2. Auftragen der Extrakte: Mittels einer Kapillare wird ein Teil des Blattextraktes 1,5 cm vom unteren Rand strichförmig (als Punktreihe!) auf eine DCPlatte (10 x 10 cm) vorsichtig aufgetragen. Die Auftragsbande sollte ca. 1 cm
von den Seitenrändern entfernt aufhören und eine möglichst große Extraktmenge enthalten.
Anmerkung: Die Kieselgelschicht darf beim Auftragen nicht verletzt werden,
da sonst das Fliessmittel nicht mehr hochziehen kann. Zu schmale, aber auch
zu breite oder überladene Startbanden ergeben schlechte Trennergebnisse.
Chromatographie: Jeweils zwei Dünnschicht-Platten (zusammen mit der der
Nachbargruppe!) werden in die vorbereitete Chromatographie-Kammer gestellt
und im Dunkeln entwickelt. Kurz bevor die Fliessmittelfront den oberen Rand
der DC-Platte erreicht hat (nach ca. 15 min) wird die Platte aus dem DC-Tank
herausgenommen. Zuerst wird die Lösungsmittelfront markiert und danach die
Positionen der verschiedenen Pigmente notiert.
gelb
ß-Carotin
grau
grün
grau
grün
Pheophytin a
Chlorophyll a
Pheophytin b
Chlorophyll b
gelb
Xanthophylle
4. Die gefärbten Zonen werden mit einer Schere ausgeschnitten, mit einem
Spatel abgeschabt und in Zentrifugengläser überführt.
Anmerkung: Die Chlorophylle müssen abgekratzt werden, solange die Platte
noch feucht ist!
5. Die einzelnen Pigmente werden mit jeweils 1 mL Lösungsmittel aus dem
Kieselgel eluiert:
Die oberste gelbe Bande mit Petroleumbenzin (40-60°C), die grünen Banden
mit Aceton und die unteren gelben Banden mit Ethanol.
Anmerkungen: Nicht klar zuordnungsbare Banden abschaben und den/die Assistenten/in (vor dem Abschaben) nach dem passenden Lösungsmittel fragen.
6
6. Zentrifugation in der Tischzentrifuge: 5 min, 4000 rpm bei 4°C. Nach dem
Zentrifugieren werden die Überstände vorsichtig abpipettiert und sofort zur
Identifikation mittels Spektrophotometrie eingesetzt.
2.1.3
Reagenzien:
Identifizierung der Blattpigmente durch Spektrophotometrie
Ethanol,
Aceton,
Petroleumbenzin (Sdp. 40-60°C).
Equipment:
automatisch registrierendes Spektralphotometer,
Pasteurpipetten,
Glasküvette (1 mL).
Durchführung:
1. Ca. 1 mL einer gefärbten Pigmentlösung werden in eine saubere Glasküvette
gefüllt. Zu stark konzentrierte Lösungen müssen gegebenenfalls mit dem jeweiligen Lösungsmittel verdünnt werden. Bei den Carotinoiden wird die Extinktion im Bereich von 500 bis 350 nm, bei den Chlorophyllen zwischen 700
und 350 nm gemessen.
Anmerkungen: Die Spektren der Carotinoide weisen, wie in den folgenden
Beispielen für Lutein und ß-Carotin gezeigt wird, drei Gipfel auf, während die
Chlorophylle jeweils zwei Hauptmaxima besitzen (Phaeophytin a besitzt vier
Absorptionsmaxima bei 408, 505, 534 und 667 nm):
Absorptionsmaxima der häufigsten Carotinoide (in nm):
Zeaxanthin
424 451 483
ß-Carotin
427 449 475
Lutein
420 445 473
-Carotin
422 444 473
Lutein-5,6-epoxid 418 442 471
Violaxanthin
420 441 471
Neoxanthin
417 438 467
Auswertung:
Dokumentieren Sie die Ergebnisse der DC sowie die Absorptionsspektren der
untersuchten Pigmente und versuchen Sie, diese anhand der angegebenen Absorptionsmaxima und des Laufverhaltens auf der DC zu identifizieren. Berechnen Sie die Rf-Werte der Pigmentbanden auf der DC-Karte.
Literatur:
G. Richter, Stoffwechselphysiologie der Pflanzen, Thieme Verlag, 6. Auflage
1998 - Das Kapitel "Die Pigmente der Photosynthese" ist empfehlenswert.
2.2 Einfluss des pH-Wertes auf die Farbe von Anthocyan und Betacyan
7
Die rot bis violett gefärbten Betacyane bilden (zusammen mit den gelb gefärbten Betaxanthinen) eine eigene Gruppe von Pigmenten, die Betalaine, die bisher nur in der Ordnung der Centrospermae mit Ausnahme der Caryophyllaceae und der Molluginaceae gefunden worden sind.
Anthocyanidin-Grundstruktur
Sie stellen Derivate der Betalaminsäure dar, die sich aus Dihydroxyphenylalanin bildet und unterscheiden sich von den Anthocyanen unter anderem durch
den Stickstoffgehalt und die elektrische Ladung. Betacyane tragen normalerweise wegen der Ionisierung der Carboxylgruppen eine negative Ladung und
wandern bei der Elektrophorese zur Anode. Anthocyane dagegen wandern
aufgrund ihrer positiven Ladung zur Kathode.
Wässrige Anthocyan- und Betacyan-Extrakte sind äußerlich meist nicht voneinander unterscheidbar. Als weiteres Unterscheidungsmerkmal wird die unterschiedliche Farbreaktion bei Änderung des pH-Wertes, in diesem Versuch demonstriert.
Pflanzenmaterial:
Rotkohl, Rote Bete
Reagenzien:
0,1 N, 1 N und 2 N HCl,
0,01 N und 0,1 N KOH,
KOH-Plätzchen
Equipment:
Waring blender,
10 Reagenzgläschen,
Trichter,
Faltenfilter
Durchführung:
1. Jeweils 5 g Rotkohl (Anthocyan) bzw. Rote Beete (Betacyan) werden in 50
mL H2O in einem Mixer homogenisiert. Die Homogenate werden über je einen
Faltenfilter filtriert.
2. Jeweils 5 mL Rotkohl-Extrakt werden in fünf Reagenzgläser (Nr. 1-5) gegeben, in gleicher Weise wird mit dem Extrakt aus Roter Beete verfahren (Gläser
6-10).
3. Nach folgendem Pipettierschema werden jetzt Säure bzw. Alkalilösungen zu
den Homogenaten gegeben und gut gemischt:
Glas-Nr.
1+6
2+7
3+8
4+9
5+10
Säure- bzw. Alkalizugabe
Kontrollen
1,0 mL 2 N HCl
0,5 mL 0,01 N KOH
1,0 mL 0,1 N KOH
1 Plätzchen KOH
Reversibel durch tropfenweise HCl-Zugabe?
0,1 N HCl
0,1 N HCl
1 N HCl
4. Erhitzen Sie nach der Prüfung auf Reversibilität die Ansätze 2+7 für 5 min
bei 100°C.
8
Auswertung:
Registrieren Sie die Farbänderungen und bestimmen Sie, ob der Farbwechsel
durch tropfenweise HCl-Zugabe reversibel gemacht werden kann. Worauf lässt
sich die Farbänderung zurückführen?
3 Amylase: Gene, Enzymaktivität, PCR,
Elektrophorese
Bei der Keimung von Getreidesamen wird kurz nach dem Quellen in der Aleuronschicht die Expression von Genen induziert, die für abbauende Enzyme kodieren. Diese hydrolytischen Enzyme werden von der Aleuronschicht in das
Speichergewebe des Getreidesamens (Endosperm) sezerniert und sind für die
Keimung unentbehrlich, da sie die im Endosperm vorhandenen unlöslichen,
hochpolymeren Reservestoffe in lösliche Produkte (monomere D-GlucoseEinheiten) umwandeln. Nur in dieser Form kann die gespeicherte Nahrung
zum Embryo transportiert und von diesem zum Wachsen ausgenutzt werden.
Wir wollen zunächst ein wichtiges, während der Keimung exprimiertes Gen,
das für die -Amylase kodiert, analysieren (Versuche unter 3.1).
Die Synthese der -Amylase (und anderer Hydrolasen) wird durch Gibberellin
induziert. Das Gibberellin wird zunächst im Embryo (Scutellum) produziert,
wandert dann in die Aleuronschicht des Endosperms und induziert dort u.a. die
-Amylase Synthese.
Die -Amylase Synthese lässt sich in physiologischen und biochemischen Experimenten untersuchen. Wir wollen in unseren Untersuchungen die Synthese
mit Hilfe verschiedener Pflanzenhormone und Hemmstoffe auf molekularer
Ebene verfolgen (Versuche unter 3.2).
3.1 Nachweis von Amylase Genen in Gerstenkeimlingen
3.1.1
Pflanzenmaterial:
Mikro-Isolation von genomischer DNA
Diese moderne Methode für die analytische Präparation von genomischer
DNA aus Pflanzenmaterial bietet verschiedene Vorteile: Sie ist sehr schnell
und das Pflanzenmaterial bleibt in Einweggefäßen, so dass Kontaminationen
weitestgehend ausgeschlossen werden (besonders wichtig für die PCRAnalyse). Die Zellen werden durch Hitze- und Detergenz-Einwirkung lysiert.
6 d alte Gerstenkeimlinge
9
Reagenzien:
CTAB-Extraktionspuffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8 plus 20 mM EDTA (pH 8)
plus 2% CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) plus 1,4 M NaCl (wird gestellt)
Equipment:
Eppendorf-Gefäße,
Mikropistill für Eppendorf-Gefäße,
Mikropipetten und Pipettenspitzen
Durchführung:
1. Ungefähr 20 mg frisches, junges Blattmaterial (ca. ein Keimling) in ein Eppendorf-Cup geben und mit 150 µl CTAB-Extraktionspuffer mit einem Mikropistill homogenisieren.
2. 500 µl CTAB-Extraktionspuffer zugeben, invertieren, und für 30 min bei
65°C inkubieren, dabei gelegentlich das Eppendorf-Cup invertieren.
3. Zugabe von 600 µl Chloroform (mit Glaspipetten! und unter dem Abzug arbeiten!). Herstellen einer Emulsion durch wiederholtes Invertieren.
4. Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge: 2 min, 10.000xg bei Raumtemperatur.
5. Obere wässrige Phase in ein neues Eppendorf-Gefäß überführen. Zugabe
von 500 µl Isopropanol, 10-20x invertieren.
6. Zentrifugation: 5 min, 10.000xg bei Raumtemperatur, Überstand mit der Pipette abziehen.
7. DNA-Pellet mit 500 µl eiskaltem 70% Ethanol (-20°C) "waschen". Nicht
schütteln!
8. Zentrifugation: 5 min, 10.000xg bei Raumtemperatur, Überstand mit Pipette
vollständig abziehen.
9. DNA-Pellet an der Luft für 5-10 min trocknen und in 50 µl H2Obidest lösen,
dann 5 min bei 65°C inkubieren.
10. Konzentrationsbestimmung von DNA: Vin der DNA-Lösung eine 1:70
Verdünnung in einem Endvolumen von 350 µL herstellen.
Anmerkungen: Die Konzentration der DNA-Lösungen wird durch Absorption
bei 260 nm (OD260) bestimmt. Eine Absorption bei 260 nm von 1 entspricht ca.
50 µg/mL doppelsträngige DNA (bei einer Schichtdicke der verwendeten
Quarzküvette von 1 cm). Zur Überprüfung der Reinheit wird zusätzlich die
Absorption bei 280 nm (OD280) bestimmt. Das Verhältnis OD260/OD280 beträgt
bei reinen Nukleinsäurelösungen ca. 2,0. Verunreinigungen durch Proteine verringern diesen Wert.
3.1.2
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR=Polymerase Chain Reaction) ermöglicht
eine enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten in vitro. Diese Methode wurde 1987 von Karl Mullis entwickelt (Mullis & Faloona (1987), Methods Enzymol. 155, 335-350). Die Polymerase-Kettenreaktion besteht im Wesentlichen aus drei Schritten:
Denaturierungsschritt: Im ersten Schritt wird die DNA denaturiert, d.h. die
DNA-Doppelstränge werden durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt. Dies
geschieht sehr schnell bei einer Temperatur zwischen 90-92°C. Bei DNA mit
extrem hohen GC-Gehalten empfiehlt sich eine Denaturierung bei 94°C.
Annealing-Schritt: Primer hybridisieren mit der Einzelstrang-Ziel-DNA und
definieren so das zu amplifizierende Fragment. Primer sind kurze DNAStücke (sog. Oligonukleotide), die als Starthilfe für die DNAPolymerasenreaktion dienen. Sie sollten möglichst spezifisch für bestimmte
10
Abschnitte der Ziel-DNA sein. Die Annealing-Temperatur ist wichtig für
die Spezifität und ergibt sich aus der Basensequenz der verwendeten Primer
(s.u.). Man sollte mit niedrigen Annealing-Temperaturen starten und die Temperatur erhöhen, wenn unspezifische Banden in der Agarose-Gelelektrophorese
(s.u.) erscheinen. Vorteile einer hohen Annealing-Temperatur sind neben der
erhöhten Spezifität auch die Möglichkeit, diesen Schritt nahe der optimalen
Polymerisations-Temperatur - also zusammen mit dem letzten Schritt, der
DNA-Synthese - durchzuführen (Two-step PCR). Durch hohe AnnealingTemperaturen werden zudem die Aufheiz- und Abkühl-Phasen und damit die
gesamte PCR-Reaktion beschleunigt.
Polymerisationsschritt: Bei 72°C erfolgt die DNA-Synthese, wobei die Syntheserate bei den am Markt gängigen DNA-Polymerasen ca. 1 kB/min beträgt.
Wichtige Faktoren, die die Ausbeute und Spezifität der PCR-Reaktion
stark beeinflussen, sind:
Magnesium: Geringe Magnesiumkonzentrationen können die Spezifität erhöhen. 1-2 mM über der Gesamtnukleotid-Konzentration ergeben gewöhnlich gute Ergebnisse (Nukleotide chelatieren Magnesium).
Nukleotide: Mindestens 25 µM jedes Desoxynukleosid Triphosphats (dNTP)
sollten eingesetzt werden. Höhere Konzentrationen können die Ausbeute erhöhen.
Primer: Die Spezifität der Primer steigt mit zunehmender Länge nur dann,
wenn auch die Annealing-Temperatur zunimmt. Mindestens 0,1 µM Primer
sollten zugesetzt werden. Hohe Primer Konzentrationen erhöhen die Ausbeute,
können aber zu unspezifischen Produktbildungen führen. Wir verwenden zwei
für das -Amylase-Gen aus Gerste (Hordeum vulgare, GenBank accession no.
M17125) spezifische Primer:
Forward-Primer: 5'-CCT CCT TGG CCT CTC GTG CAG C-3'
Reverse-Primer: 5'-CGG CAT AGT CAT TGC CAT GCG C-3'
Die Annealing Temperatur lässt sich bei Primern mit <30 Basen nach folgender Formel berechnen:
Tm = 69,3 + 0,41 * (GC%) - 650 / (Länge des Primers bp)
Die Annealing-Reaktion sollte 2-5°C unterhalb des durchschnittlichen Tm der
beiden verwendeten Primer durchgeführt werden.
Sie werden in diesem Versuch die Abhängigkeit der PCR-Reaktion von verschiedenen Faktoren (z.B. Einfluss der eingesetzten Menge an genomischer
DNA oder Primer) untersuchen.
Equipment:
200 µl PCR-Gefäße,
Automatische Gilson-Pipetten (0-20 µl, 0-100 µl),
Eisbad,
Vortex-Mixer,
Mikrozentrifuge,
Programmierbaren Thermocycler mit heizbarem Deckel (siehe Abbildung
links).
Reagenzien:
Werden gestellt.
Durchführung:
1. Folgende Bestandteile des PCR-Ansatzes werden als Master-Mix für 5 Ansätze auf Eis zusammenpipettiert:
10 µl 10xPCR-Puffer (mit 15 mM MgCl)
11
10 µl DMSO (30 %)
10 µl dNTPs (jeweils 2 mM)
[10 µl Forward-Primer (FP), s.o. (Standard: 2 pmol/µl)]
[10 µl Reverse-Primer (RP), s.o. (Standard: 2 pmol/µl)]
10 µl DNA-Polymerase (0,25 Unit/µl)
[40 µl DNA-Template (Standard: 10 µg)]
2. Master-Mix gut mixen und auf vier PCR-Gefäße (12µl pro Gefäß bei variabler DNA-Template bzw. 16 µl bei variabler Primer Konzentration) verteilen.
3. bei Versuch a. Einfluss der DNA-Template-Menge auf die PCR das DNA
Template so verdünnen, dass sich entweder 0, 200 pg, 20 ng oder 2 µg DNA in
8 µl befinden oder
für Versuche b. Einfluss der Primer auf die PCR z.B. 2 µl FP und 2 µl RP, 2 µl
FP und 2 µl H2O, 2 µl RP und 2 µl H2O, oder 4 µl H2O
zu den entsprechenden Master-Mixen hinzugeben. Das Gesamtvolumen pro
Ansatz beträgt 20 µl.
4. Der Thermocycler wird mit folgendem Temperaturprogramm programmiert:
1. Schritt:
94°C für 5 min,
2. Schritt:
94°C für 30 s,
3. Schritt:
60°C für 30 s,
4. Schritt:
72°C für 2 min,
5. Schritt:
72°C für 5 min.
Die Schritte 2-4 werden 35 mal wiederholt.
5. Die vier Ansätze werden in 35 Zyklen amplifiziert.
6. Nach Abschluss des PCR-Laufes (nach ca. 2 h) werden die Proben entweder
direkt für die Agarose-Gelelektrophorese vorbereitet, oder aber bei -20°C gelagert.
3.1.3
Reagenzien:
Equipment:
Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese
Die Analyse und Auftrennung von Nukleinsäuren erfolgt mit Hilfe der Gelelektrophorese, mit deren Hilfe geladene Moleküle in einem elektrischen Feld
getrennt werden. DNA-Moleküle sind wegen ihres Zucker-Phosphat-Rückgrats
negativ geladen und wandern zur Anode (positiver Pol). Je größer die Moleküle sind, desto langsamer wandern sie. Dies geschieht in einer elektrisch neutralen Gelmatrix aus Agarose. Mit der Agarose-Konzentration (zwischen 0,5 und
2%) lässt sich die Porengröße beeinflussen. Zur Trennung relativ kleiner Moleküle, wie in unserem Fall, eignen sich Agarose-Konzentrationen von 1,0 bis
1,7%.
Agarose,
50xTAE-Puffer: 2 M Tris plus 50 mM EDTA, pH 7,8 mit konz. Essigsäure
einstellen (wird gestellt),
Beschwererlösung: 40% Sucrose (w/v) in H2Obidest plus 0,25% Bromphenolblau,
DNA-Längenstandards: 0,1 µg/µl Standard DNA in 20% Beschwererlösung,
GelRed-Färbelösung: 1:3300 (v:v).
Mikrowelle,
Flachbett-Gelelektrophorese-Apparatur (siehe Abbildung links),
Power-supply,
Automatische Pipette (10 µl) plus Pipettenspitzen.
12
Durchführung:
1. Gießen des Agarose-Gels: Zur Herstellung eines 1,0%igen Agarosegels
werden 0,5 g Agarose mit 50 mL 1xTAE-Puffer versetzt.
2. Flachbett Geltray mit Tesa-Krepp an den offenen Rändern abkleben und den
"Kamm" mit der gewünschten Anzahl an "Zähnen" (8 oder 11) an geeigneter
Position auf das Tray stecken. Die "Zähne bilden später die "Geltaschen" im
Agarose-Gel.
3. In der Mikrowelle kurz aufkochen lassen, vorsichtig schütteln (Vorsicht:
heiß!), erneut aufkochen bis sich die Agarose gelöst hat.
4. Die Agarose-Lösung auf 50°C abkühlen lassen. Dann die Agarose-Lösung
in das vorbereitete Flachbett Geltray gießen und 30 min abkühlen lassen.
5. Das Tesa-Krepp entfernen, das Gel in die Elektrophorese Kammer platzieren und mit 1x TAE-Puffer überschichten. Der Kamm wird jetzt vorsichtig aus
dem Gel entfernt, die Geltaschen füllen sich dabei mit TAE-Puffer.
6. Beladen des Gels: Die zu analysierenden PCR-Proben aus 3.1.2 werden mit
20 Vol.% (4 µL) Beschwererlösung versetzt, durchmischt und auf Eis gekühlt.
In der äußersten linken Geltasche wird 0,8 µg DNA-Längenstandard aufgetragen, daneben je 10 µL der PCR-Proben.
7. Die Gelkammer wird an das Power-Supply angeschlossen. Die
Elektrophorese erfolgt für ca. 1½ h bei 80 V (30-35 mA). Sie ist beendet, wenn
das Bromphenolblau ca. 2/3 des Gels durchwandert hat.
8. Anfärben des Gels: Das Gel wird in der GelRed-Färbelösung für ca 15 min
gefärbt und anschließend 5 min in H2O entfärbt.
Bemerkungen: Handschuhe tragen, Hautkontakt vermeiden!
9. Das Gel wird auf einem UV-Transluminator gelegt und mit UV-Licht der
Wellenlänge 254 nm durchstrahlt. Die fluoreszierenden DNA-Banden werden
mit einer Video-Kamera aufgenommen und in einem geeigneten Programm am
PC ausgewertet.
Auswertung:
Wie groß waren Ihre Ausbeuten an genomischer DNA?
Wie hoch ist die errechnete Annealing Temperatur der verwendeten Primer?
Welche Größe erwarteten und welche Größe erzielten Sie für Ihr PCRFragment?
Wie lässt sich dieser Versuch Ihrer Meinung nach optimieren?
3.2 Gibberellinsäure induzierte Amylase Expression im Getreideendosperm
Wird in Gerstenkörnern die eigene Gibberellin Produktion durch Entfernen des
Embryos unterbunden, ist die Expression der -Amylase-Gene im restlichen
Endosperm von zugegebenem Gibberellin abhängig. Die Aktivität der Amylase ist dem Logarithmus der Gibberellin Konzentration proportional.
Diese Wirkung wird vielfältig als sehr empfindlicher Biotest für das Pflanzenhormon genutzt. Abscisinsäure hingegen wirkt antagonistisch zu Gibberellin.
Wir wollen in diesem Versuch den Einfluss von Gibberellinsäure und die Abscisinsäure auf die -Amylase Induktion verfolgen und die Genexpression auf
Transkriptions- und Translationsebene untersuchen.
3.2.1 Induktion der Amylase-Synthese
Pflanzenmaterial: ca. 50 Gerstesamen (Hordeum vulgare L.)
Reagenzien:
ca. 500 ml H2Obidest, steril,
ca. 100 ml Acetat/CaCl2-Puffer, steril: (1 mM Acetat mit 10 mM CaCl2; pH
13
4.8): zur Herstellung des Puffers wird Lösung A: Natriumacetat (1 mM) mit
CaCl2 (10 mM), durch Zugabe von Lösung B: Essigsäure (1 mM) mit CaCl2
(10 mM) auf pH 4.8 eingestellt,
GA3-Lösung: Gibberellinsäure wird in einem sauberen Gefäß in sterilem Acetat/CaCl2-Puffer gelöst (10 µg/mL, Stammlösung mit 1 mg/ml in Ethanol wird
gestellt),
ABA-Lösung: Abscisinsäure in sterilem Puffer ansetzen (100 µg/mL, Stammlösung mit 1 mg/mL in Ethanol wird gestellt),
Actidion: (2 mg/mL) hemmt die Translation, wird gestellt.
Equipment:
Rasierklingen (Heftpflaster),
mehrere sterile Erlenmeyerkolben (50 mL, mit Alufolie versehen!),
mehrere sterile Pipetten (5 mL; 2 mL; 0,1 mL),
sowie einige Vorratsgefäße für die Hormonlösungen.
Durchführung:
1. Eine ausreichende Menge an Gerstesamen werden quer halbiert. Die embryoenthaltenden (Spelzen zu) und embryofreien, rauen (Spelzen offen) Hälften
sind dabei streng auseinander zu halten.
2. Die halbierten Kornhälften werden kurz in 70% Ethanol sterilisiert und anschießend 2x mit sterilem H2O gewaschen.
3. Streng getrennt nach embryoenthaltenden und embryofreien Hälften werden
die Gerstenhalbsamen in sterile Erlenmeyerkolben gegeben und mit den angegebenen Lösungen versetzt:
4,0 mL Acetat/CaCl2 + 10 Halbsamen mit Embryo
4,0 mL Acetat/CaCl2 + 10 Halbsamen ohne Embryo
3,8 mL Acetat/CaCl2 + 200 µL GA3-Lösung + 10 Halbsamen ohne Embryo
3,6 mL Acetat/CaCl2 + 200 µL GA3 + 200 µL ABA + 10 Halbsamen ohne
Embryo
3,6 mL Acetat/CaCl2 + 200 µL Actidion + 10 Halbsamen ohne Embryo, nach
mindestens 30 min Inkubation zusätzlich 200 µL GA3
Vorsicht! Actidion ist sehr giftig! Handschuhe tragen, Hautkontakt vermeiden!
4. Alle Kolben werden für 1 d bei 25°C unter Schütteln inkubiert und danach
wie nachfolgend beschreiben weiter verarbeitet.
3.2.2
Reagenzien:
Equipment:
Amylase Extraktion, Enzymtests, und Eichgeraden
Acetat/CaCl2-Puffer, wie unter 3.2.1,
Stärkelösung: 50 mg Kartoffelstärke, 300 mg KH2PO4 und 10 mg CaCl2 werden in 50 ml H2Odest. gelöst und 1 min lang gekocht. Die Lösung wird nach
dem Abkühlen gegebenenfalls zentrifugiert. Der klare Überstand wird vorsichtig vom Niederschlag abgegossen und aufgehoben,
Jodjodkalium/HCl: 0,6 g KJ und 0,06 g Jod werden unter dem Abzug kurz gemörsert und in 10 mL Wasser gelöst. Die Lösung wird in einer braunen Flasche aufbewahrt (Stammlösung wird gestellt). Unmittelbar vor Gebrauch wird
0,5 mL dieser Lösung zu 49,5 mL 0,05 N HCl gegeben und gut eingemischt.
Binokular,
Mörser und Pistill,
Wasserbad 25°C,
Spektrophotometer,
Tischzentrifuge,
Reagenzgläser,
mehrere Pipetten (5 mL; 2 mL; 0.1 mL).
14
Durchführung:
1. Schauen Sie sich von den ersten vier Ansätzen jeweils einen Halbsamen
unter dem Binokular an und skizzieren Sie ihre Beobachtungen!
Anmerkungen: In der Abbildung links sind embryofreie Gerstenhalbsamen
dargestellt, die in Wasser (oben rechts), in 10-9 M GA3 (Mitte) oder in 10-7 M
GA3 (unten links) für 2 d inkubiert wurden.
2. Die Halbsamen werden nach der Inkubationszeit zusammen mit dem Inkubationsmedium und einer Spatelspitze Seesand in einen Porzellanmörser gegeben und mittels Pistill auf Eis homogenisiert. Das Rohhomogenat wird möglichst vollständig in Glaszentrifugenröhrchen auf Eis überführt und der Mörser
mit 2 mL Puffer nachgespült.
Anmerkung: Zwischen den Homogenisationen der einzelnen Inkubationsansätze müssen Mörser und Pistill jedes Mal gründlich gereinigt werden.
3. Die 5 Rohhomogenate werden für 10 min bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert und die erhaltenen Überstände mit Pasteurpipetten in saubere eisgekühlte
Reagenzgläschen überführt und auf Eis gelagert. Das so erhaltene Homogenat
wird für den -Amylase Enzymtest eingesetzt.
4. Jeweils 500 µL der 5 Homogenate mit Acetat/CaCl2-Puffer auf 1 mL auffüllen.
5. Die Testansätze und die Stärkelösung werden 5 min lang bei 25°C im Wasserbad äquilibriert (besonders wichtig bei quantitativen Bestimmungen):
6. Start der Enzymreaktion: Zum Testansatz 1 mL der Stärkelösung geben, sofort gut einmischen und ins Wasserbad zurückstellen.
7. Stopp der Enzymreaktion: 5 min nach dem Start 1,0 mL Jodjodkalium/HCl
zugeben und gut vermischen.
Anmerkungen: Durch Jodjodkalium/HCl werden die Enzyme inaktiviert, und
die Reaktion hört sofort auf. Die noch vorhandene Stärke bildet mit JJK einen
blaugefärbten Komplex. Die Extinktion der Proben wird bei 620 nm gegen
Wasser gemessen. Es ist darauf zu achten, dass unmittelbar nach dem Abstoppen gemessen wird. Vor dem Eingießen in die Messküvetten müssen die Proben gut aufgewirbelt werden, da der Jod-Stärke-Komplex mit ausgefallenen
Proteinen aggregiert und langsam zu Boden sinkt. Es ist darauf zu achten, dass
für die Auswertung nur solche Messwerte brauchbar sind, bei denen die Extinktion ungefähr im Bereich von 0,2 bis 1,0 liegt. Sollte dies nicht der Fall
sein, ist die eingesetzte Homogenatmenge entsprechend zu variieren.
Eichgeraden:
8. Herstellen einer Stärke-Eichgeraden: 7 Reagenzgläser werden mit einer ansteigenden Reihe Stärkelösung von 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, bzw. 0,4 mL gefüllt, mit Acetat/CaCl2-Puffer auf ein Volumen von 2 mL gebracht und dann
mit jeweils 1 mL Jodjodkalium/HCl versetzt.
Auswertung:
Auftragen der Eichreihe. Bestimmen Sie mit Hilfe der Eichgeraden die Menge
an abgebauter Stärke (in mg/min/10 Halbsamen) für die 5 Testansätze. Bedenken Sie dabei, dass die photometrisch ermittelten Stärkemengen in den Enzymtests die nicht umgesetzte Stärke darstellen!
Was lässt sich aus Ihren Beobachtungen zur Regulation der -Amylase Genexpression aussagen?
Literatur:
L. Taiz & E. Zeiger, Plant Physiology, Sinauer Associates, Inc., Publishers, 5th
ed. 2010 - Das Kapitel "Gibberellins" wird empfohlen.
15
Anhang:
-Amylase Gen (Nukleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz) aus GenBank accession no. M17125). Die Exons sind fett dargestellt, die verwendeten Primer sind unterstrichen!
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121
181
241
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1
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329
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1501
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354
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374
1681
394
1741
414
1801
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1921
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