CARACTERISATION DE PERTURBATEURS ENDOCRINIENS AU

Transcription

UNIVERSITE DE MONTPELLIER 1
UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES
CARACTERISATION DE PERTURBATEURS
ENDOCRINIENS AU COURS DU TRAITEMENT DES EAUX
USEES A L’AIDE D’OUTILS BIOANALYTIQUES
Thèse présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE MONTPELLIER I
ECOLE DOCTORALE : SIBAGHE
(Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences et Environnement)
FORMATION DOCTORALE : Science de l’eau dans l’environnement continental
N° DE SECTION CNU : 67
SPECIALITE : Biologie des populations et écologie
PAR
Sonia DAGNINO
Ingénieur Agronome
Soutenue le 7 Décembre 2009
JURY
Mr Patrick BALAGUER, Chargé de recherche, INSERM U896
Co-directeur de thèse
M. Jean-Pierre CRAVEDI, Directeur de Recherche, INRA, Toulouse
Rapporteur
M. Robert DURAN, Professeur, Université de Pau, Pau
Examinateur
Mme Hélène FENET, Maître de conférences, Université Montpellier 1
Directeur de thèse
Mme Guillermina HERNANDEZ-RAQUET, Chargée de Recherche, INRA, LBE, Narbonne
Examinateur
M. Jean-Marc PORCHER, Directeur de Recherche, INERIS, Verneuil-en-Halatte
Rapporteur
Les perturbateurs endocriniens (PE) sont des substances capables d’interférer avec le bon
fonctionnement du système endocrinien. Ces substances d’origine naturelle, ou de synthèse,
sont issues de l’activité humaine, des rejets urbains, des décharges industrielles. Ces rejets
convergent vers les stations de traitement des eaux usées (STEPs). La capacité d’élimination
de ces substances, dans les eaux usées, par les STEPs, conditionne la contamination du milieu
récepteur, c’est donc une source de polluants qui doit être maitrisée. L’objectif de ce travail a
été de caractériser le devenir des PE au cours du traitement des eaux usées. Le suivi a été fait
à l’aide de bioessais : des lignées cellulaires bioluminescentes qui permettent la détection de
ligands des récepteurs aux estrogènes (ER), du récepteur aryl hydrocarbone (AhR) et du
récepteur Pregnane X (PXR). L’étude des activités ER et AhR au cours de différents
traitements, démontre que le lagunage est plus efficace que les boues activées et le lit
bactérien pour leur élimination. Les activités portées par les matières en suspension ne sont
que très faiblement, ou pas dégradées au cours du traitement. L’élimination de l’activité dans
la phase particulaire est uniquement due à l’exportation des MES au cours du traitement. Afin
d’améliorer la caractérisation des activités et pour guider leur identification par analyse
chimique, nous avons mis au point divers outils de bioanalyse. Parmi cela, une méthode de
concentration et purification spécifique des ligands du récepteur PXR par du récepteur
recombinant immobilisé sur sépharose. Cette méthode a permis de déterminer la présence de
ligands communs aux trois récepteurs ER, AhR et PXR dans un échantillon de sédiment puis
dans des boues de station d’épuration.
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RESUME ............................................................................................................................................................... 2
REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................ 4
TABLE DES MATIERES .................................................................................................................................... 7
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................................... 10
LISTE DES FIGURES ....................................................................................................................................... 10
LISTE DES ABREVIATIONS .......................................................................................................................... 12
AVANT-PROPOS ............................................................................................................................................... 13
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS .................................................................................................. 17
............................................................................ 19
II.. LES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS ............................................................................................... 21
I.1.
DEFINITION DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS .............................................................................. 21
I.1.1
Le système endocrinien ................................................................................................................. 21
I.1.2
Perturbateurs endocriniens........................................................................................................... 22
I.2.
MODES D’ACTION DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS ..................................................................... 22
I.2.1
Liaison aux récepteurs nucléaires du système endocrinien .......................................................... 22
I.2.1.1
Définition des récepteurs nucléaires ......................................................................................................... 23
I.2.1.2
Organisation structurale des récepteurs nucléaires ................................................................................... 24
I.2.1.3
Les récepteurs des estrogènes (ER) .......................................................................................................... 26
I.2.1.4
Le récepteur des Prégnanes X (PXR) ....................................................................................................... 30
I.2.1.5
D’autres récepteurs nucléaires cibles de perturbateurs endocriniens ........................................................ 32
I.2.2
Le récepteur Aryl Hydrocarbone (AhR) ........................................................................................ 34
I.2.2.1
Structure et rôles de AhR.......................................................................................................................... 34
I.2.2.2
Interactions avec ERα
α............................................................................................................................... 35
I.2.2.3
Ligands environnementaux de AhR.......................................................................................................... 36
I.3.
ORIGINE DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS .................................................................................. 37
I.3.1
Origine naturelle ........................................................................................................................... 37
I.3.2
Origine anthropique...................................................................................................................... 38
I.3.2.1
Dérivés industriels .................................................................................................................................... 38
I.3.2.2
Les produits pharmaceutiques et cosmétiques .......................................................................................... 43
I.3.3
I.4.
Réglementation.............................................................................................................................. 44
CONSEQUENCES D’EXPOSITION ........................................................................................................... 45
I.4.1
Effets des perturbateurs endocriniens sur la faune aquatique ...................................................... 45
I.4.1.1
Chez les invertébrés.................................................................................................................................. 45
I.4.1.2
Chez les poissons...................................................................................................................................... 46
I.4.2
Effets des perturbateurs endocriniens sur l’homme ...................................................................... 46
I.4.2.1
Exposition in utero : le cas du DES .......................................................................................................... 47
I.4.2.2
Exposition aux doses environnementales : exemple du DDT ................................................................... 47
7
I.4.2.3
Exposition accidentelle : La catastrophe de Seveso.................................................................................. 48
I.4.2.4
Exposition chronique : perturbateurs endocriniens et cancer.................................................................... 49
IIII.. METHODES BIOANALYTIQUES DE DETECTION DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS
DANS L’ENVIRONNEMENT .......................................................................................................................... 50
II.1.
METHODES DE DETECTION IN VITRO .................................................................................................... 50
II.1.1
Test de liaison compétitive au récepteur ....................................................................................... 50
II.1.2
Anisotropie de fluorescence .......................................................................................................... 51
II.1.3
Tests basés sur des réponses enzymatiques................................................................................... 53
II.2.
METHODES DE DETECTION IN CELLULO ............................................................................................... 54
II.2.1
Test de prolifération cellulaire...................................................................................................... 54
II.2.2
Induction de l’expression de protéines.......................................................................................... 54
II.2.3
Modèles cellulaires avec gènes rapporteurs ................................................................................. 55
II.2.3.1
Le test YES.......................................................................................................................................... 55
II.2.3.2
Lignées cellulaires bioluminescentes................................................................................................... 56
II.3.
METHODES DE DETECTION IN VIVO ...................................................................................................... 61
II.4.
CONCLUSIONS SUR LES MODELES DE DETECTION ................................................................................ 62
II.5.
HARMONISATION ET EVALUATION DES METHODES ............................................................................. 63
IIIIII.. PERTURBATEURS ENDOCRINIENS DANS LE CYCLE DE L’EAU URBAINE............................. 64
III.1.
INTRODUCTION ................................................................................................................................... 64
III.2.
LE TRAITEMENT DE L’EAU .................................................................................................................. 65
III.2.1
Le traitement primaire.............................................................................................................. 65
III.2.2
Le traitement secondaire .......................................................................................................... 66
III.2.3
Le traitement tertiaire............................................................................................................... 66
III.3.
PERTURBATEURS ENDOCRINIENS DANS LE TRAITEMENT DES EAUX USEES .......................................... 67
III.3.1
Niveaux de contamination des effluents urbains ...................................................................... 67
III.3.2
Abattements et taux d’élimination ............................................................................................ 68
III.3.2.1
Les traitements primaires..................................................................................................................... 68
III.3.2.2
Les traitements biologiques ................................................................................................................. 69
III.3.2.3
Les traitements par lagunage et filtres plantés..................................................................................... 70
III.3.3
Perturbateurs endocriniens dans les boues et compost............................................................ 71
III.3.4
Niveaux de contamination des effluents de STEP..................................................................... 73
III.4.
CONTAMINATION DU MILIEU RECEPTEUR ET RECYCLAGE ................................................................... 74
III.4.1
Contamination des eaux de surface et sédiments ..................................................................... 74
III.4.2
Contamination de la ressource en eau par la réutilisation des eaux usées .............................. 76
79
........................................................................................................................
113
.............................................................
8
.................................................................................. 133
163
....................................................................................................................
................................................................................................................ 171
............................................................................................................................................................. 209
9
Tableau 1 Structure tridimensionnelle du LBD de ERα en conformation agoniste et
antagoniste................................................................................................................................ 28
Tableau 2 Potentiel relatif d’activation de ERĮ par différentes molécules.............................. 29
Tableau 3 Structures tridimensionnelles du domaine LBD de PXR en présence de trois ligands
différents................................................................................................................................... 31
Tableau 4 Potentiel relatif d’activation de AhR par différentes molécules ............................. 36
Tableau 5 Quelques exemples de ligands naturels pouvant agir comme PE .......................... 37
Tableau 6 Historique de la stratégie européenne pour les perturbateurs endocriniens ............ 44
Tableau 7 Exemples de tests ELISA disponibles sur le marché .............................................. 53
Tableau 8 Modèles de poissons couramment utilisés pour la détection de PE dans l'eau ....... 61
Tableau 9 Abattement de l'activité estrogénique dans différents procédés de traitements ...... 69
Tableau 10 Activités estrogéniques détectées en sortie de traitement ..................................... 73
Tableau 11 Activités ERĮ et AhR detectées dans divers types de sédiments .......................... 75
Figure 1 Système endocrinien chez l’Homme ......................................................................... 21
Figure 2 Arbre phylogénique des récepteurs nucléaires de mammifères................................. 24
Figure 3 Schéma de l’organisation modulaire générale des RN .............................................. 24
Figure 4 Mode de liaison à l'ADN des récepteurs nucléaires .................................................. 25
Figure 5 Représentation schématique des récepteurs des estrogènes Į et ȕ humains .............. 27
Figure 6 Représentation schématique de la structure de AhR ................................................. 34
Figure 7 Structure Nonylphénol ............................................................................................... 38
Figure 8 Structure de la TCDD ................................................................................................ 39
Figure 9 Structure générale des PCB ....................................................................................... 40
Figure 10 Structure du.............................................................................................................. 40
Figure 11 Liste des 16 HAP dans la liste prioritaire de l’EPA ................................................ 42
Figure 12 Structure du TBT ..................................................................................................... 42
Figure 13 Incidence et mortalité dues au cancer du sein chez la femme de 1950 à 2006........ 49
Figure 14 Principe de la technique de liaison compétitive au récepteur ou "binding" ............ 51
Figure 15. Principe de l’anisotropie de fluorescence .............................................................. 52
10
Figure 16. Représentation schématique du mode de fonctionnement des lignées cellulaires
MELN....................................................................................................................................... 57
Figure 17. Représentation schématique du mode de fonctionnement des lignées HAhLP...... 59
Figure 18. Représentation schématique du mode de fonctionnement des lignées HG5LNPXR
.................................................................................................................................................. 60
Figure 19 Couverture géographique de la population ayant accès à l’assainissement............. 64
Figure 20 Représentation schématique du dispositif général de station d’épuration des eaux
usées (STEP) ............................................................................................................................ 65
Figure 21 Niveaux d’activité estrogénique des effluents urbains à travers le monde (ng/L E2
Eq.) ........................................................................................................................................... 67
11
LBD
Domaine de liaison au ligand
Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Luc
Luciférase
Aliments
M
AhR
Aryl Hydrocarbon Receptor
MAE
Extraction Assisté par Micro-onde
APnEO
Alkylphénol polyéthoxylate
AR
Recépteur aux androgènes
MR
Récepteur des Minéralocorticoïdes
A
AFSSA
(Microwave Assisted Extraction)
N
C
CALUX
Chemically activated luciferase gene expression
NP
Nonylphénol
CAR
Récepteur Constitutive Androstane
NPm
Nonylphénols en mélange
CYP450
Cytochrome P450
O
OCDE
D
Organisation for Economic Co-operation and
Development
DBD
Domaine de liaison à l’ADN
DDT
Dichlorodiphényltrichloroéthane
OMS
Organisation Mondiale de la Santé
DES
Diéthylstilbestrol
OP
4-tert-octylphénol
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagles Medium
P
PBB
E
polybromobiphényle
E1
Estrone
PCB
polychlorobiphényle
E2
17-ȕ Estradiol
PCDD
polychlorodibenzodioxines
E3
Estriol
PCDF
polychlorodibenzofuranes
EC50
Concentration permettant d’obtenir 50%
PE
perturbateurs endocriniens
d’activité
PPAR
Récepteur aux activateurs de la prolifération des
peroxysomes
EE2
Ethinylestradiol
Eq. E2
Equivalents estradiol
PR
Récepteur de la progestérone
Eq. SR12813
Equivalents SR12813
PXR
Récepteur des pregnanes X
Eq. TCDD
Equivalents TCDD
R
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
RAR
ELRA
Enzyme Linked Receptor Assay
REACH
EPA
Environmental Protection Agency
ER
Récepteur des estrogènes
RPA
Potentiel relatif d’activation
ERE
Element de réponse aux estrogènes
RXR
Récepteur aux ReXinoïdes
EROD
Ethoxyrésorufine-O-Dééthylase
S
ERR
Récepteur “Estrogen-Related”
STEP
GR
TBBPA
(Fœtal Calf Serum)
TBT
Tributylétain
TCDD
2,3,7,8-Tetrachloro-dibenzo-p-dioxine
Récepteur thyroïdien
Chromatographie en phase Gazeuse couplée à la
TR
Spectrométrie de Masse
U
Récepteur aux glucocorticoïdes
UNICEF
Hydrocarbures aromatiques polycycliques
INVS
United Nations Children's Fund
VTG
Vitellogénine
W
I
INSERM
Tetrabromobisphénol-A
V
H
HAP
Station d’épuration des eaux usées
Sérum de veau fœtal
G
GC-MS
Registration, Evaluation, Authorisation and
Restriction of Chemicals
T
F
FCS
Récepteur aux rétinoïdes
Institut National de la Santé et de la Recherche
WHO
World Health Organisation
Médicale
WWTP
Waste Water Treatment Plant
Institut de Veille Sanitaire
X
XRE
K
Koc
Coefficient de partage carbone organique/eau
Y
Kow
Coefficient de partage octanol/eau
YES
Element de réponse aux xénobiotiques
Yeast Estrogen screen
L
12
Avant-Propos
L’essor des nouvelles technologies et le progrès scientifique ont permis des avancées
considérables depuis le début du 20ème siècle. Ce progrès a engendré un développement
massif de l’activité humaine, industrielle, et de l’urbanisation et par conséquent l’émergence
de nombreuses substances chimiques présentes sur le marché. Ces substances se retrouvent
dans le compartiment aquatique, transportées par les eaux usées domestiques, les eaux
industrielles et les eaux de ruissellement urbain. Au cours du siècle dernier, des travaux de
recherche ont démontré que certaines molécules pouvaient induire des effets néfastes sur la
reproduction et le développement de nombreuses espèces. En 1960, Rachel Carson observe
les effets du dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT), un pesticide utilisé massivement entre
1950 et 1960, sur la reproduction des oiseaux et publie « Le printemps silencieux » qui met en
évidence les effets sur la santé de la faune suite à l’exposition à des substances chimiques.
Dans les années 80, l’imposex induit par le tributylétain est observé sur des populations
d’huîtres dans le bassin d’Arcachon, puis chez d’autres espèces. Ces observations ont conduit
à la réglementation de son usage. En 1990, des études sur la faune aquatique en Angleterre
montrent des anomalies sur les organes reproducteurs chez diverses espèces de poissons, dues
à des rejets de station d’épuration dans les rivières concernées. Ces études ont conduit à
mettre en évidence l’existence de substances chimiques capables de perturber l’équilibre
hormonal et le système endocrinien. Aussi en 1995 et 1996, le concept de « perturbateurs
endocriniens (PE) » prend forme. Les PE sont définis comme « une substance ou un
mélange exogène altérant les fonctions du système endocrinien et induisant des effets
nocifs sur la santé d’un organisme intact, de ses descendants ou (sous) population »
[Kavlock et al., 1996].
Les PE peuvent agir à différents niveaux. Une des voies majeures de perturbation passe par
l’activation des récepteurs du système endocrinien tels que les récepteurs nucléaires,
notamment le récepteur aux estrogènes (ER) et le récepteur aux prégnanes (PXR), ainsi que le
récepteur cytosolique aryl hydrocarbone (AhR). Des méthodes globales permettent de
mesurer le potentiel PE d’une substance. Ces méthodes sont des essais réalisés in vitro ou in
vivo basés sur l’action des substances sur les récepteurs concernés. Les différentes méthodes
disponibles ont permis de classer de nombreuses substances comme PE. On peut citer les
hormones naturelles et de synthèse, les alkylphénols, les hydrocarbures aromatiques
polycycliques, les biphényls polychlorés, les phtalates, le bisphénol-A, les retardateurs de
13
Avant-Propos
flammes bromés, les dioxines et furanes, et les pesticides. La liste des PE augmente au fur et à
mesure que la recherche dans ce domaine progresse.
La présence de PE dans l’environnement et le risque qu’ils représentent souligne un réel
besoin d’établir des stratégies permettant l’identification, la détection et la quantification de
ces polluants dans l’environnement. Le large panel de substances mises en cause rend parfois
difficile leur suivi. L’analyse chimique permet de détecter et quantifier des substances
connues, mais elle ne prend pas en compte leurs effets biologiques. L’utilisation de modèles
in vitro basés sur les mécanismes d’action des PE permet la détection de l’activité globale
d’un mélange de contaminants présents dans l’environnement. Les modèles in vitro ont
également l’avantage de détecter la présence de contaminants non recherchés lors des
analyses chimiques. De plus, l’évolution du génie génétique a contribué à améliorer
considérablement les tests in vitro, permettant d’obtenir des lignées cellulaires de plus en plus
sensibles et sélectives qui permettent des criblages rapides. Le développement de ces tests a
permis la mise en évidence de PE dans différents compartiments environnementaux et
l’identification des sources de contamination.
Les effluents de station d’épuration (STEP) ont été identifiés comme source de PE dans le
milieu aquatique. Divers travaux ont été menés pour déterminer le devenir des PE au cours du
traitement des eaux usées. En effet, pour réduire le transfert de PE vers les milieux naturels et
minimiser les effets néfastes sur la faune, un des moyens d’action consiste à en limiter
l’apport à la source et par conséquent, permet d’évaluer et d’améliorer les capacités de
traitement des STEP. Ces travaux se sont intéressés au suivi de l’activité estrogénique au
cours de traitements classiques (boues activées, précipitation physico chimique,...).
Cependant, les informations ne concernent majoritairement que la phase dissoute des eaux
usées. L’implication de la phase particulaire ainsi que l’activité portée par les boues a été peu
étudiée.
Les bioessais permettent de déterminer la présence de l’ensemble des PE présents dans un
échantillon et peuvent guider l’analyse chimique. Cependant les analyses chimiques couplées
à la détection d’activités in vitro ne permettent pas toujours d’établir de bonnes corrélations
et l’activité observée n’est pas toujours expliquée par la présence des substances analysées.
Les PE les plus connus sont des ligands des récepteurs ER et AhR. Des études récentes ont
montré que le récepteur PXR pouvait être une cible de molécules environnementales. Des
échantillons de sédiment de rivière et de boues de STEP contiennent des activateurs de PXR.
Si les corrélations entre bioessais et analyse chimique pour des molécules connues permettent
d’expliquer assez bien les activités des échantillons pour les récepteurs ER et AhR, cette
14
Avant-Propos
même approche ne permet pas d’expliquer l’activité mesurée sur PXR. L’activité PXR dans
l’environnement est encore inexpliquée à ce jour et les travaux existant concluent souvent sur
le besoin de développer des outils bioanalytiques afin de guider l’identification des ligands de
ce récepteur.
Dans ce contexte, l’objectif de ce travail a été d’améliorer les connaissances disponibles
concernant le suivi et le devenir des PE ligands de ER, AhR et aussi PXR dans le traitement
des eaux usées. Le suivi a été réalisé à l’aide de la mesure d’activités par des bioessais in
vitro. Le développement de divers outils de bioanalyse a permis la caractérisation des activités
mesurées, et de proposer des familles de substances pouvant être responsables des activités
observées dans le but d’orienter de futures analyses chimiques.
Ce manuscrit est articulé autour de cinq chapitres.
Ö Le Chapitre 1 est une synthèse bibliographique sur la problématique des PE, leur mode
d’action, leurs effets ainsi que les diverses techniques disponibles pour leur mesure et
enfin leur présence dans le cycle de l’eau urbaine.
Les trois chapitres suivants exposent les résultats expérimentaux et leur interprétation,
présentés sous forme d’articles en anglais.
Ö Dans le Chapitre 2, nous présentons le devenir de ligands des récepteurs ER et AhR au
cours du traitement des eaux usées dans des filières de traitement par lagunage, lit
bactérien et boues activées. La contribution de la phase particulaire à l’activité globale est
étudiée dans ces différents types de traitements.
Ö Dans le Chapitre 3, nous décrivons l’établissement d’une méthode de concentration et de
purification biospécifique des ligands du récepteur PXR par du récepteur recombinant. En
utilisant des récepteurs recombinants ER et PXR, nous avons pu séparer en partie les
substances responsables des activités ER, PXR et AhR d’un échantillon environnemental.
Il a aussi été possible de déterminer qu’il existait des ligands communs aux trois
récepteurs.
Ö Dans le Chapitre 4, nous avons appliqué ces outils à l’étude des eaux usées. A l’aide de
lignées cellulaires bioluminescentes, des récepteurs recombinants ER et PXR, d’anticorps
15
Avant-Propos
dirigés contre des hormones stéroïdiennes, nous avons caractérisé qualitativement les
activités ER, AhR et PXR dans les eaux, matières en suspension et boues de STEP.
Ö Enfin un regard critique sur les résultats, les démarches ainsi que les perspectives
ouvertes par ce travail sont présentées en Conclusion.
16
Publications et Communications
Publications
Gomez E., Wang X., Dagnino S., Leclercq M., Escande A., Casellas C., Picot B., Fenet H. Fate of endocrine disrupters
in waste stabilisation ponds systems. Water Science and Technology, 55(11), 157-163 (2007).
Arthur David, Sonia Dagnino, Yves Pichot, Dominique Munaron, Aurélie Escande, Claude Casellas, Hélène Fenet,
Elena Gomez. Temporal study of estrogenic responses of mussel (Mytilus galloprovinciallis) extracts applied to reporter
cell lines. Marine Environmental Research, 66(1), 105-107 (2008).
Patureau D, Hernandez-Raquet G, Balaguer P, Delgenes N, Muller M, Dagnino S, Delgenes JP. Relevant approach to
assess performances of wastewater biosolids composting in terms of micropollutants removal. Water Science and
Technology, 58(1), 45-52 (2008).
le Maire A, Grimaldi M, Roecklin D, Dagnino S, Vivat-Hannah V, Balaguer P, Bourguet W. Activation of RXR-PPAR
heterodimers by organotin environmental endocrine disruptors. EMBO Report, 10(4), 367-73. (2009).
Sonia Dagnino, Bernadette Picot, Aurélie Escande, Patrick Balaguer, Helène Fenet .Occurrence and removal of
endocrine disrupters in small communities waste water treatment plants. Désalination and Water treatment, 4, 93-97,
(2009).
Sonia Dagnino, Elena Gomez, Bernadette Picot, Claude Casellas, Patrick Balaguer, Helène Fenet. Suspended solids in
wastewater treatment and agonistic ERĮ and AhR activities. Soumis à Science of the total environment.
Communications orales
David A., Dagnino S., Fenet H., Pichot Y., Escande A., Munaron D., Gomez E. Temporal study of estrogenic
responses of mussel (Mytilus galloprovinciallis) extracts applied to reporter cell-lines. PRIMO 14, 14th International
Symposium Pollutant Reponses in Marine Organisms. 6-9 Mai 2007. Florianopolis Brasil
M. Muller, D. Patureau, P. Balaguer, N. Delgenes, S. Dagnino, JP. Delgenes, G. Hernandez-Raquet. Assessment of
estrogenic and xenobiotic receptor activities in combination with chemical analysis of micropollutants during
wastewater biosolids composting. 24-25 Juin 2007, IWA 4th Organic Residuals and Biosolids Management Conference.
Moncton, New Brunswick, Canada.
Dagnino S., Picot B., Escande A., Balaguer P., Fenet H. Occurrence and removal of endocrine disrupters in small
communities waste water treatment plants. 11-15 Novembre 2007. SmallWat07 Wastewater Treatment in Small
Communities, Seville, Espagne.
17
Publications et Communications
S. Dagnino, Anne Riu, Mélanie Martin, Daniel Zalko, Vincent Cavaillès, Hélène Fenet, Patrick Balaguer.
Environmental endocrine disruptors purification by recombinant ER a, PXR and PPAR g - affinity columns. 5-8 Mai
2008, Cascade annual meeting, Bruxelles, Belgique.
Sonia Dagnino, Anne Riu, Vincent Cavaillès, Matthew Redinbo, Sélim Aït-Aïssa, Helène Fenet, Patrick Balaguer.
Caractérisation de polluants perturbateurs endocriniens dans l’environnement à l’aide d’outils de capture biospécifiques. Journée ERICHE 2008, Cap-Hornu, 2-3 octobre 2008.
Sonia Dagnino, E. Gomez, B. Picot, P. Balaguer, H. Fenet. Characterization and partition of estrogenic, dioxin-like and
PXR activities in WWTP, comparison of different treatment technologies. XENOWAC, xenobiotics in water cycle,
Cyprus, 11-13 March 2009.
Posters
Riu A., Dagnino S., Escande A., Zalko D., Balaguer P., Development of affinity columns for the identification of food
contaminants able to interfere with nuclear receptors. 17-19 Avril 2007, Cascade annual Meeting, Helsinki, Finlande.
Riu A., Dagnino S., Perdu E., Zalko D., Balaguer P., Binding of radio-labeled estrogenic compounds to recombinant
estrogen receptor-Į (ERĮ) immobilized on a nickel column. Juin 2007 Cascade, Spetses, Grèce.
Sonia Dagnino, Anne Riu, Vincent Cavaillès, Matthew Redinbo, Sélim Aït-Aïssa, Aurélie Escande, Hélène Fenet,
Patrick Balaguer. Environmental endocrine disruptors purification by recombinant Pregnane X and Estrogen receptoraffinity columns. 5th SETAC World Congress - 3-7 August 2007, Sydney Australia.
Sonia Dagnino, Anne Riu, Vincent Cavaillès, Matthew Redinbo, Sélim Aït-Aïssa, Aurélie Escande, Hélène Fenet,
Patrick Balaguer. Purification de perturbateurs endocriniens par du récepteur PXR et ER recombinant. Colloque
environnement chimique, reproduction et développement de l’enfant. 25 Novembre 2008, MEEDAT, Paris, France.
18
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20
Chapitre I . Synthèse Bibliographique- Les Perturbateurs Endocriniens
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Le système endocrinien, avec le système
nerveux, assure les mécanismes permettant
le maintien de l’homéostasie, la régulation
du
comportement, le développement, la
reproduction de l’organisme humain, mais
également d’autres espèces (Figure 1). Il
assure la régulation d’un nombre important
de
processus
biologiques
comme
la
glycémie (avec l’insuline pancréatique), la
Figure 1 Système endocrinien chez l’Homme
croissance, le développement du cerveau et du
[Purves et al., 2004]
système nerveux (avec les estrogènes et les hormones thyroïdiennes). Il se compose d’organes
excréteurs représentés par les glandes exocrines et endocrines, qui synthétisent et libèrent des
hormones dans l’organisme. Les trois axes principaux du système endocrinien sont les axes
hypothalamus-hypophyse-gonades,
hypothalamus-hypophyse-thyroïde
et
hypothalamus-
hypophyse-glandes adréno-corticales. Les hormones, relarguées dans la circulation générale,
agissent en tant que messagers chimiques grâce à la présence de récepteurs spécifiques situés
sur les organes cibles. Lorsque l’hormone se fixe, l’organe cible engage une réponse à cette
stimulation qui se traduit par l’activation de la transcription des gènes et une modification de
l’expression des protéines.
Chez les vertébrés on distingue divers types d’hormones :
Ö Les hormones dérivées d'amines, qui sont constituées d'un seul acide aminé (la tyrosine
ou le tryptophane). Il s’agit entre autre, des neurotransmetteurs (adrénaline, noradrénaline,
dopamine) et des hormones thyroïdiennes (TSH, triiodothyronine T3, thyroxine T4).
Ö Les hormones peptidiques, comme l'insuline et l'hormone de croissance somatotropine.
Ö Les hormones stéroïdiennes, qui sont des stéroïdes dérivés du cholestérol. Cette classe
regroupe les hormones sexuelles (estrogènes et androgènes), les glucocorticoïdes, les
minéralocorticoïdes et les progestatifs.
21
Ö Les hormones dérivées d’acides gras, dont les eicosanoïdes forment la classe principale,
parmi lesquelles on trouve les prostaglandines. Ces substances constituent une classe de
ligands agonistes naturels des récepteurs PPAR (Peroxysome Proliferator Activated
Receptors).
Ö Les hormones dérivées de la vitamine A. Ce groupe comprend la vitamine A et ses
métabolites, les acides rétinoïques, ligands naturels des récepteurs des rétinoïdes (RAR et
RXR).
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Un perturbateur endocrinien (PE) est une substance exogène capable d’altérer les fonctions du
système endocrinien et par conséquent d’induire des effets sur un organisme, sa progéniture
ou une population [Kavlock et al., 1996; WHO, 2002]. Les perturbateurs endocriniens
peuvent être d’origine naturelle ou de synthèse. Ils sont présents de façon ubiquitaire dans les
chaînes alimentaires et dans l’environnement.
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De part la compléxité des voies endocrines, la perturbation par les PE s’efectue à de
nombreux niveaux.
9 Au niveau de la synthèse des hormones
9 Au niveau des protéines plasmatiques de transport des hormones
9 Au niveau de la capture des hormones par les cellules cibles
9 Au niveau des enzymes du métabolisme et du catabolisme hormonal
9 Au niveau des récepteurs cibles des hormones ou des protéines associées
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La majorité des effets des PE observés est attribuée à leur action sur les récepteurs nucléaires
leurs mode d’action consiste à :
9 se lier au récepteur en mimant un effet agoniste ou antagoniste
9 perturber l’activité du récepteur par le déclenchement de voies alternatives
9 alterer la disponibilité des hormones dans la cellule
22
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Les récepteurs nucléaires forment une superfamille de facteurs transcriptionnels impliqués
dans la régulation de gènes cibles spécifiques participants aux processus biologiques comme
le métabolisme, le développement et la reproduction [Mangelsdorf et al., 1995; Laudet, 1997].
Au cours de l’évolution, les récepteurs nucléaires ont évolué en facteurs de transcription
capables de lier un ligand.
L’alignement des séquences d’acides aminés des récepteurs nucléaires et la construction d’un
arbre phylogénique ont permis à l’équipe de V. Laudet de les classer en 6 sous-familles de
taille inégale. Cette classification est représentée dans la Figure 2. On distingue :
Ö Les récepteurs de type I
Il s’agit de la plus vaste sous-famille. Elle regroupe les récepteurs des hormones thyroïdiennes
(TR), les récepteurs de l’acide rétinoïque (RAR), le récepteur de la vitamine D3 (VDR,
NR1I1), le récepteur constitutif de l’androstane (CAR, NR1I3), le récepteur activé par les
prégnanes (PXR, NR1I2), les récepteurs activant la prolifération des peroxysomes (PPAR),
les récepteurs des oxystérols ainsi que quelques récepteurs orphelins comme RORγ (RARrelated Orphan Receptor).
Ö Les récepteurs de type II
La seconde sous-famille contient les récepteurs des rexinoïdes (RXR Į,ȕ,γ, Retinoid X
Receptor), ainsi que d’autres récepteurs orphelins comme COUP-TF (Chicken Ovalbumine
Upstream Promoter transcription factor) et HNF-4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4).
Ö Les récepteurs de type III
La troisième sous-famille regroupe les récepteurs stéroïdiens comme les récepteurs des
estrogènes (ER), les récepteurs des androgènes (AR), de la progestérone (PR), des
minéralocorticoïdes (MR) et glucocorticoïdes (GR), ainsi que les récepteurs apparentés aux
ER (ERR, Estrogen-Related Receptors).
Ö Les récepteurs de type IV, V, VI
Ces trois branches sont constituées de récepteurs orphelins dont NGFI-B (type 4), SF-1 et
FTZ-1 (type 5) et GCNF (type 6).
23
Figure 2 Arbre phylogénique des récepteurs nucléaires de mammifères
d’après [Laudet, 1997].
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Les récepteurs nucléaires possèdent une structure modulaire comprenant plusieurs régions qui
correspondent chacune à un domaine fonctionnel particulier nécessaire à l’activité
transcriptionelle. Cette structure est commune à tous les récepteurs nucléaires (RN)(Figure 3).
Figure 3 Schéma de l’organisation modulaire générale des RN
(Les six régions constituant les récepteurs nucléaires sont identifiées par une lettre (de A à F) ; Les régions A/B, C (DBD) et
E (LBD), correspondent aux domaines dont les fonctions et structures ont été caractérisées.)
24
I.2.1.2.1 La région A/B
La région A/B comporte une fonction de transactivation (AF-1) qui est dite « indépendante du
ligand » car lorsque cette région est isolée du reste du récepteur, elle présente une activité
transcriptionelle constitutive. En revanche, dans le contexte du récepteur entier, la présence du
ligand est nécessaire à son activation. Cette région confère une spécificité de réponse en
fonction du type cellulaire et des promoteurs cibles. Sa longueur et sa séquence sont très
faiblement conservées entre les différents récepteurs.
I.2.1.2.2 La région C ou DBD
Le domaine C est le domaine d’interaction avec l’ADN (DBD pour « DNA Binding
Domain »). Il s’agit du domaine le plus conservé de la superfamille des récepteurs nucléaires.
Il confère à la protéine la capacité de reconnaître une séquence d’ADN, très courte mais
spécifique, au niveau de promoteurs de gènes cibles, afin d’activer leur transcription. Ces
séquences consensus sont nommées HRE (Hormone Responsive Element). Les récepteurs
nucléaires peuvent se lier à l’ADN de plusieurs manières [Glass, 1994] (Figure 4) :
Ö En formant un hétérodimère avec RXR. C’est le cas par exemple des récepteurs PXR ou
TR.
Ö En formant des homodimères sur un élément de réponse en répétition directe.
Ö En se fixant sous forme d’homodimères sur un élément de réponse palindromique. C’est
le cas des récepteurs stéroïdiens tels que les ER.
Ö En se fixant sous forme monomérique sur des demi-sites.
Figure 4 Mode de liaison à l'ADN des récepteurs nucléaires
D’après [Mangelsdorf et al., 1995]
25
I.2.1.2.3 La région D
La région charnière, ou domaine D, est une région hypervariable qui relie le DBD au LBD.
Elle confère au récepteur une capacité de rotation intramoléculaire. Cette charnière permet au
DBD de pivoter jusqu'à 180° de son axe d'origine afin de diminuer les contraintes dues à la
liaison sur l'HRE [Glass, 1994]. De plus, pour certains récepteurs, en particulier pour AR,
cette région comprend une séquence particulière appelée NLS (pour nuclear localization
signal). Elle permet le transport du récepteur vers le noyau de la cellule lors de la fixation du
ligand [Guiochon-Mantel et al., 1996].
I.2.1.2.4 La région E ou LBD
Le LBD (« Ligand Binding Domain »), ou région E, est un domaine multifonctionnel qui est
responsable de nombreuses fonctions des récepteurs nucléaires. Il confère à la protéine la
capacité de lier le ligand et d'initier la transactivation. Il permet la dimérisation des récepteurs,
et renferme des séquences NLS de localisation nucléaire. C’est également le site de liaison de
cofacteurs.
I.2.1.2.5 La région variable carboxy-terminale
Cette région adjacente au LBD est de petite taille et de séquence très variable. Elle semble
impliquée de manière différente dans l'activation des récepteurs. Pour ER Į ou ȕ, cette région
de 40 acides aminés semblerait avoir une action dans la répression par les anti-estrogènes
[Montano et al., 1995]. A l'inverse, pour les récepteurs GR, AR et MR, cette région ne semble
pas directement impliquée dans la liaison du ligand mais aurait un rôle stabilisateur puisque la
délétion des 4 acides aminés de l’extrémité carboxyterminale empêche la liaison du ligand
[Couette et al., 1998; Tahiri et al., 2001].
%0 #+",&# #!/12
I.2.1.3.1 Structure et rôle physiologique des ER
Les effets prédominants des estrogènes passent par l’intermédiaire de deux récepteurs
nucléaires, le récepteur des estrogènes ERĮ [Green et al., 1986] et son isoforme, le récepteur
des estrogènes ERȕ [Kuiper et al., 1996]. La structure des deux ERs, représentée Figure 5, est
proche de celle des autres récepteurs nucléaires [Pike, 2006]. Les deux isoformes présentent
des homologies dans certains domaines fonctionnels (notamment les régions C et E). Le
domaine A/B est cependant différent, indiquant que ces deux récepteurs n’activent pas
26
toujours les mêmes gènes et jouent donc un rôle différent dans l’organisme [Hall and
McDonnell, 2005].
Figure 5 Représentation schématique des récepteurs des estrogènes Į et ȕ humains
[basée sur Koehler et al. 2005]
Le LBD des ER est composé de 12 hélices-α, organisées en 3 couches et de 2 feuillets ȕ
(Tableau 1). Cette organisation est commune à la plupart des récepteurs nucléaires et crée au
centre de la structure une cavité hydrophobe qui constitue la poche de liaison du ligand [Pike,
2006]. L’hélice 12 agit comme un couvercle venant se positionner, ou non, sur cette cavité en
fonction de la nature du ligand. Pour les ligands agonistes on constate une fermeture de
l’hélice alors qu’il n’y a pas de fermeture pour les molécules antagonistes (Tableau 1). Le
ligand est stabilisé par des liaisons hydrogènes fortes dans ses extrémités et des liaisons
faibles de Van der Waals au cœur de la molécule. La liaison du ligand dans la poche nécessite
la présence d’un noyau phénolique. La poche des ER est considérablement plus large que le
ligand [Brzozowski et al., 1997].
Les LBD de ERĮ et ERȕ ne différent que par 2 acides aminés : la méthionine 421 d’ERĮ
correspond à l’isoleucine 373 pour ERȕ et la leucine 384 de ERĮ à la méthionine 336 pour
ERȕ. Cette différence a cependant un effet direct sur le volume de la poche de liaison (plus
petite pour ERȕ) et contribue à la sélectivité des ligands pour chaque isotype [Pike, 2006].
27
Tableau 1 Structure tridimensionnelle du LBD de ERα en conformation agoniste et antagoniste
[Pike, 2006]
Conformation de ERα avec un ligand
Conformation de ERα avec un ligand
agoniste (hélice H12 repliée)
antagoniste (hélice H12 flottante)
I.2.1.3.2 Ligands environnementaux de ERĮ
On distingue trois types de ligands de ERĮ pouvant se retrouver dans l’environnement : les
estrogènes naturels, les ligands de synthèse à but thérapeutique et les ligands de synthèse à but
non thérapeutique.
Les ligands naturels des ERĮ sont des estrogènes d’origine humaine (hormones féminines :
estradiol E2, estrone E1, estriol E3) ou végétale (phytoestrogènes : génistéine, daidzéine,
biochanine-A ; mycoestrogènes : la zéaralenone et ses métabolites) [Pillon et al., 2005;
Escande et al., 2006].
Il existe divers types de ligands de synthèse à but thérapeutique pour le récepteur aux
estrogènes α :
Ö d’une part, les hormones de synthèse utilisées comme agent de contraception
(éthynilestradiol, EE2) ou en tant qu’hormone de remplacement lors de la ménopause
(tibolone), qui sont généralement des agonistes de ERĮ.
Ö d’autre part, des anti-cancéreux, utilisés pour inhiber la prolifération cellulaire dans le
cancer du sein, ceux-ci étant généralement des antagonistes du récepteur (tamoxifène,
fluvestrant, hydroxytamoxifène).
Les ligands de synthèse à but non thérapeutique sont des molécules qui s’avèrent être actives
sur le récepteur des estrogènes alors qu’elles n’ont pas été conçues dans cet objectif. Elles
sont issues de l’industrie, comme les alkylphénols, les phtalates, le bisphénol-A, les
28
polychlorobiphényles (PBC) ou bien utilisées en agriculture comme les pesticides, le DDT, le
1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophényl)éthylène (DDE), le méthoxychlore, le chlordécone et la
vinclozoline [Lemaire et al., 2006a; Molina-Molina et al., 2006]. On compte également
certaines substances présentes dans les cosmétiques comme certains muscs et parabènes ainsi
que divers écrans UV [Schlumpf et al., 2001; Schlumpf et al., 2004; Gomez et al., 2005].
Enfin certains métaux lourds (cobalt, cadmium, mercure) sont des activateurs des ER [GarciaMorales et al., 1994; Stoica et al., 2000; Denier et al., 2009].
Le tableau 2 répertorie certains activateurs de ER ainsi que leur activité relative par rapport à
l’estradiol (ligand de référence) (RPA). Celle-ci peut être de 10 à 100 000 fois plus faible que
celle de l’estradiol. Les hormones de synthèse ont généralement une bonne affinité pour le
récepteur (Kd<1nM). Inversement, les autres xénoestrogènes ont une affinité faible pour le
récepteur (Kd>1nM).
Tableau 2 Potentiel relatif d’activation de ERĮ par différentes molécules
Potentiel estrogénique de molécules testées sur les lignées MELN. Le potentiel relatif a été déterminé comme étant le ratio de
la concentration en E2 effective pour atteindre 50 % d’activité divisé par celle de la molécule.
Substance
RPA
Références
Ethynylestradiol
246
[Pillon et al., 2005]
17-ȕ Estradiol
100
Zéaralenone
5.62
[Kinani et al., 2009]
Génistéine
0.064
[Escande et al., 2006]
Bisphénol-A
0.018
p-p’-DDT
0.0017
[Li et al., 2008]
Nonylphénol
0.00016
p-p’-DDT
0.0017
[Li et al., 2008]
Benzophénone 2
0.000043
[Molina-Molina et al., 2008]
Vinclozoline
0.0000055
[Molina-Molina et al., 2008]
29
%3 #+",&# #+/(12
I.2.1.4.1 Structure et rôle physiologique de PXR
Le récepteur PXR joue un rôle important dans le développement et la physiologie des
organismes. Ce récepteur a été nommé récepteur aux prégnanes X (PXR, NR1I2) car il est
activé par certaines prégnanes synthétiques et naturelles. La structure du récepteur PXR est
proche du récepteur CAR et VDR. Trois équipes distinctes ont cloné PXR [Lehmann et al.,
1998], [Blumberg et al., 1998] et [Uppenberg et al., 1998]. PXR est considéré comme un
récepteur nucléaire orphelin car aucun ligand naturel n’a été identifié jusqu’à aujourd’hui. Il
est l’un des acteurs majeurs dans les mécanismes de détoxification des subtances
xénobiotiques. Il agit comme un détecteur de xénobiotiques et protège donc l’organisme
[Kliewer and Willson, 2002]. L’activation de PXR permet, entre autre, la régulation du
métabolisme des stéroïdes endogènes. Il est également impliqué dans l’homéostasie lipidique
en facilitant la lipogenèse et en régulant les voies d’élimination du cholestérol.
Lors de la liaison d’un ligand à PXR, celui-ci forme alors un hétérodimère avec son partenaire
RXRα afin d’activer la transcription de gènes cibles [Bendz et al., 2005]. L’activation de
PXR régule l’expression de nombreux gènes dont celui du cytochrome CYPA3A (de la
famille des cytochromes P450) impliqué dans le métabolisme des drogues et des
xénobiotiques, la synthèse du cholestérol, des stéroïdes et des lipides. Pour cette
raison, l’activation de PXR par des xénobiotiques peut être aussi bien bénéfique que néfaste.
Elle va induire la métabolisation des xénobiotiques qui sont donc rapidement éliminés de
l’organisme, ce qui est bénéfique. Elle peut aussi induire la métabolisation précoce de
molécules thérapeutiques qui n’auront pas eu le temps d’atteindre leur cible. Cette activation à
double tranchant a été bien décrite dans trois revues [Biswas et al., 2009; di Masi et al., 2009;
Fang and Zhang, 2009].
La cristallisation de PXR avec différents ligands a permis d’élucider la structure très
particulière du domaine LBD [Watkins et al., 2003b; Chrencik et al., 2005; Xue et al., 2007a;
Xue et al., 2007b; Wang et al., 2008b]. Le domaine LBD de PXR est organisé en 3 couches
d’hélices-α en sandwich et de 5 feuillets-ȕ (Tableau 3). Les autres récepteurs nucléaires n’ont
typiquement que 2 ou 3 feuillets. La poche de PXR est extrêmement hydrophobe et son
volume est plus grand (1200 Å3) [Watkins et al., 2001] que celui des autres récepteurs
nucléaires (490 Å3 pour ERĮ) [Pike, 2006]. De plus, la poche de PXR est extrêmement
flexible et est capable de s’adapter à la forme de la molécule liée (Tableau 3). La flexibilité de
30
la poche de PXR explique le large panel de ligands capables de le lier, allant d’un acide
biliaire à des molécules complexes tels que la rifampicine (Tableau 3). Cette flexibilité est
certainement aussi la raison pour laquelle tous les ligands de PXR sont des agonistes et qu’il
est très difficile de synthétiser une molécule antagoniste [Xue et al., 2007a].
Tableau 3 Structures tridimensionnelles du domaine LBD de PXR en présence de trois ligands différents
SR12813
Rifampicine
17-ȕ Estradiol
[Watkins et al., 2003a]
[Chrencik et al., 2005]
[Xue et al., 2007b]
I.2.1.4.2 Ligands environnementaux de PXR
PXR est activé par un grand nombre de molécules, des produits pharmaceutiques
(antibiotiques, anticancéreux, antidépresseurs, antihypercholestérolémiants, antiépileptiques),
ainsi que d’autres familles de polluants environnementaux comme des pesticides
organochlorés, des alkylphénols, des phyto- et mycoestrogènes, des hormones naturelles et de
synthèse, des écrans UV (pour revue [di Masi et al., 2009]). La plupart de ces ligands se fixent
à PXR avec une affinité très faible, supérieure à 1µM (EC50). Des ligands d’affinité de
l’ordre du nM ont cependant pu être synthétisés afin d’obtenir une bonne affinité pour la
poche du récepteur [Lemaire et al., 2007; Xue et al., 2007a; Benod et al., 2008].
31
%4 )(&##+",&#&"-+($#"$'- ,#&#'(&# !"#$$
D’autres récepteurs nucléaires sont également des cibles de perturbateurs endocriniens. C’est
le cas du récepteur des androgènes (AR), du récepteur aux activateurs de la prolifération des
peroxysomes (PPARγ), des récepteurs des hormones thyroïdiennes (TRĮ et TRȕ), des
récepteurs reliés aux estrogènes (ERR), ainsi que du récepteur constitutive androstane (CAR).
I.2.1.5.1 AR
Le récepteur AR est l’acteur majeur dans la voie hormonale de la testostérone, hormone
stéroïdienne mâle et de ses métabolites. Son LBD comprend 290 acides aminés et représente
30% du récepteur. Il est composé de 12 hélices-Į formant la poche de liaison du ligand [Sack
et al., 2001].
Certains ligands environnementaux de ERĮ sont des antagonistes du récepteur AR. Les
travaux de Tamura et al. (2006), suggèrent que cet antagonisme serait dû à la plus petite taille
du LBD de AR. Les ligands de ER, trop volumineux, fixés dans la poche de liaison du AR
empêcheraient le repli de l’hélice H12 et agiraient ainsi comme antagonistes. Parmi ces
antagonistes, on peut citer les hormones féminines naturelles et de synthèse (estradiol, estriol,
éthynilestradiol), le bisphénol-A, le 4-nonylphénol diéthoxylate, la vinclozoline, des
benzophénones ainsi que divers phtalates [Roy et al., 2004; Molina-Molina et al., 2008].
Il existe également des antagonistes de AR qui ne se lient pas aux récepteurs ER comme
l’heptachlore et la dieldrine [Roy et al., 2004; Tamura et al., 2006] ou l’antibactérien triclosan
[Tamura et al., 2006]. Certains Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) tels que le
fluoranthène et le benzo(a)pyrène ont été décrits comme antiandrogéniques [Vinggaard et al.,
2000] mais leur mécanisme d’action passe probablement par l’activation du récepteur Aryl
Hydrocarbone (AhR) [Ohtake et al., 2003; Ohtake et al., 2008]. Curieusement très peu de
molécules ont été décrites comme agonistes de ce récepteur, hormis le 1,2-dibromo-4-(1,2dibromoethyl)cyclohexane (TBECH) [Khalaf et al., in press]. Cependant des études de
l’activité d’échantillons environnementaux ont pu montrer la présence de ligands agonistes de
ce récepteur [Kinani et al., 2009; Mnif et al., in press].
32
I.2.1.5.2 PPAR
Les récepteurs PPAR existent sous 3 isoformes, α, γ et δ. Les PPAR agissent en
s’hétérodimérisant avec leur partenaire RXR. L’activation des PPAR contrôle le métabolisme
lipidique et glucidique, la cicatrisation et le processus inflammatoire. Les isoformes PPAR α
et γ sont activées par certains phtalates [Hurst and Waxman, 2003; Bility et al., 2004; Feige et
al., 2007]. PPARĮ est activé par les pesticides diclofop-methyl, pyrethrines et imazalil
[Takeuchi et al., 2005]. Il a été montré que PPARγ est activé par certains organoétains [Grun
and Blumberg, 2006; Grun et al., 2006; Casals-Casas et al., 2008], notamment le tributylétain
(TBT) et le triphénylétain (TPT). Cependant, des études récentes ont montré que l’activation
de l’hétérodimère RXR-PPAR par les organoétains, serait due principalement à RXR (voir
chapitre I.3).
I.2.1.5.3 TR
Les récepteurs aux hormones thyroïdiennes (TR) existent sous deux isoformes, Į et ȕ. Les TR
sont activés de façon endogène par l’hormone thyroïdienne T3. Les PE ayant un effet
(anti)thyroïdien peuvent induire des perturbations au niveau du taux d’hormones circulantes,
de la fonction de la glande thyroïde, du transport des hormones dans le sang ainsi qu’au
niveau de la liaison de l’hormone sur son récepteur. On décompte un certain nombre de
polluants industriels pouvant se fixer à TR, comme certains PCB [Fritsche et al., 2005], le
bisphénol-A [Moriyama et al., 2002] et également des retardateurs de flamme bromés, tel que
le tétrabromobisphénol-A (TBBPA) [Kitamura et al., 2005].
I.2.1.5.4 ERR
Les récepteurs ERR (Estrogen Related Receptors) existent sous trois isoformes α, β, γ. Les
ERRs font partie de la famille des récepteurs nucléaires orphelins. Ils sont capables de se lier
sur des éléments de réponse à ERR (ERRE) mais aussi à des éléments de réponse des
estrogènes (ERE). Les ERR sont activés par diverses molécules dont certains antiestrogènes
(hydroxytamoxifène) et estrogènes (bisphénol-A, génistéine, DES) [Li et al., 2009].
33
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Le récepteur Aryl hydrocarbone (AhR ou AHR, parfois aussi appelé récepteur à la dioxine
DR) est un facteur de transcription cytosolique qui appartient à la superfamille des protéines
basic helix-loop-helix (bHLH-PAS). Les protéines bHLH-PAS agissent comme des
régulateurs dans divers processus physiologiques en contrôlant des réponses d’adaptation aux
changements environnementaux. Elles régulent l’expression de gènes impliqués dans des
processus biologiques fondamentaux, tels que la différenciation et le maintien du cycle
cellulaire, les voies d'homéostasie ou de réponse à un stress [Massari and Murre, 2000]. Cette
superfamille est caractérisée par un domaine de liaison à l'ADN (bHLH) et un domaine de
dimérisation (ZIP ou PAS). Dans sa région N-terminale, AhR contient des séquences de
localisation et d’export nucléaire (NLS et NES), les motifs bHLH et PAS, un site de liaison
aux ligands, ainsi que des sites de liaison aux protéines chaperonnes. Le domaine de
transactivation (TAD, Transactivation Acting Domain) se trouve dans sa région C-terminale
(Figure 6).
Figure 6 Représentation schématique de la structure de AhR
En absence de ligands, AhR est présent dans le cytoplasme et complexé par des protéines
chaperonnes. La liaison du ligand provoque la translocation de AhR dans le noyau où il se
dimérise avec la protéine partenaire Arnt. L’hétérodimère AhR-Arnt se lie à l’ADN sur
l’élément de réponse XRE (« Xenobiotic Response Element ») situé au niveau des promoteurs
des gènes cibles. La liaison à XRE provoque le recrutement de coactivateurs puis la
transcription des gènes cibles. L’induction de AhR résulte en une expression accrue des gènes
cibles tels que CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, glutathione-S-transferase (GST), NADPHquinone oxydoréductase et xanthine oxydase. Les produits de l’activation d’AhR sont
impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques et des substances endogènes comme les
hormones stéroïdiennes. Il faut noter que AhR après activation s’associe avec des composants
34
du protéasome, complexe multiprotéique, localisé dans le cytoplasme, qui est responsable de
la destruction des protéines cytosoliques dont la cellule doit se débarrasser.
%%% #("$!(8"α
α
Diverses études se sont intéressées aux interactions entre les récepteurs ERĮ ҏet AhR. Plusieurs
groupes ont montré que ERĮ et AhR interagissent entre eux et forment un complexe ternaire
avec Arnt [Ohtake et al., 2003; Wormke et al., 2003; Beischlag and Perdew, 2005; Matthews
et al., 2005b]. Ohtake et son équipe (2003) ont montré que ce complexe se liait sur les ERE et
l’interaction entre ERĮ et AhR dépend de la présence du ligand AhR. De plus, le 3méthylcholanthrène (3MC), un ligand de AhR, est capable d’induire l’activation partielle de
gènes estrogèno-régulés [Ohtake et al., 2003; Ohtake et al., 2008]. Les raisons de cette
activation partielle par les ligands de AhR ne sont pas élucidées. Cependant, il pourrait s’agir
d’un recrutement non optimal des co-activateurs transcriptionnels de ERĮ.
En présence d’estradiol, les ligands de AhR diminuent la réponse induite par l’estrogène. Cet
effet anti-estrogénique pourrait être du à la dégradation de ERĮ par le protéasome. En effet,
les travaux de l’équipe de [Wormke et al., 2003] ont montré que la dégradation de ERĮ par le
protéasome était beaucoup plus importante lors du co-traitement par un ligand de AhR et de
ERĮ que par le traitement par un seul des ligands. L’agonisme partiel des ligands de AhR peut
expliquer les effets à la fois estrogéniques et anti-estrogéniques décrits dans la bibliographie.
En fonction du contexte cellulaire ou tissulaire et de la concentration en co-activateurs, la
dioxine peut être plus ou moins active en absence d’estradiol. La concentration en estrogènes,
en ERĮ et AhR, ainsi que l’activité du protéasome peuvent aussi moduler différemment l’effet
des ligands de AhR sur la réponse estrogénique.
La modulation de la transcription de gènes cibles de AhR, par le complexe ERĮ-AhR, a été
moins étudiée [Matthews et al., 2005a]. D’après cette équipe, les estrogènes auraient un effet
activateur sur l’expression du gène CYP1A1. Ce résultat est en contradiction avec les résultats
d’une autre équipe qui a montré qu’au contraire les estrogènes diminuaient l’activité
transcriptionnelle de AhR [Beischlag and Perdew, 2005]. Ce dernier résultat est en accord
avec plusieurs travaux plus anciens qui ont montré que l’activité EROD (activité enzymatique
du gène CYP1A1) chez le poisson était également inhibée par l’estradiol.
L’effet des estrogènes et de ERĮ sur l’activité de AhR paraît contradictoire et leur interaction
est difficile à comprendre. De plus, les ligands de AhR ou leurs métabolites hydroxylés
[Pearce et al., 2004; Abdelrahim et al., 2006] peuvent être des ligands de ERĮ, ce qui rend
encore plus complexe la compréhension de ces interactions.
35
Pour conclure, on retiendra que le complexe ERĮ-AhR se lie sur des promoteurs de gènes
contenant des ERE et des XRE. Les ligands de AhR peuvent être considérés comme des
agonistes partiels pour les réponses estrogéniques [Ohtake et al., 2003; Ohtake et al., 2008].
En présence de dioxine, l’effet des estrogènes et de ERĮ est plus complexe.
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AhR peut être activé par des substances naturelles et synthétiques de structure différente. Les
ligands environnementaux les plus connus de AhR sont les polychlorodibenzodioxines
(PCDD) et les polychlorodibenzofuranes (PCDF), notamment la 2,3,7,8-Tetrachloro-dibenzop-dioxine (TCDD), capable d’activer AhR à de faibles concentrations (0,2 nM) [Pillon et al.,
2005]. Certains Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) sont aussi des ligands de
AhR, notamment le benzo(a)pyrène et le 3MC, ainsi que certains PCB. Le tableau 4 indique
le potentiel relatif d’activation par rapport à la TCDD de différents ligands de AhR. Leur
activité peut être de 1,5 à 800 fois moins forte que celle de la TCDD.
Tableau 4 Potentiel relatif d’activation de AhR par différentes molécules
Le potentiel relatif d’activation de AhR par rapport à la TCDD de molécules testées sur plusiueurs modèles cellulaires. Le
RPA a été déterminé comme le ratio de la concentration effective en TCDD obtenue pour 50 % d’activité, sur celle de la
molécule.
Substance
2,3,7,8-TCDD
RPA
Référence
1
2,3,7,8-TBDD
0.76
[Behnisch et al., 2003]
2,3,7,8-TBDF
0.32
[Brown et al., 2004]
1,2,3,7,8-PBDF
0.14
[Brown et al., 2004]
Dibenzo(a,h)anthracène
0.12
[Louiz et al., 2008]
PCB 126
0.067
Benzo(a)pyrène
0.033
PCB 81
0.0042
PCB 169
0.0034
PCB 77
0.0013
TBDD : tétrabromodibenzo-p-dioxine –TBDF: tétrabromodibenzofurane - PBDF : pentabromodibenzofurane
36
0 Comme nous l’avons évoqué au cours du paragraphe précédent, les PE peuvent être d’origine
naturelle ou de synthèse.
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Les perturbateurs endocriniens d’origine naturelle comprennent les hormones endogènes
naturellement présentes dans l’organisme humain et animal, ainsi que les phyto et
mycoestrogènes.
L’hormone féminine 17-ȕ estradiol (Tableau 5) est excrétée à environ 4,71 µg/j chez la
femme non ménopausée [Liu et al., 2009]. L’origine naturelle de cette molécule nous fait
oublier son potentiel de contamination. En effet, les hormones et leurs conjugués sont excrétés
par l’organisme et déversés dans les eaux usées. Sans traitement approprié au niveau des
stations d’épuration, ces substances sont rejetées dans l’environnement et deviennent des
contaminants au même titre que d’autres xénobiotiques. Dans les eaux usées, elles ont étés
mesurées à des concentrations allant de 1 à 35 ng/L [Lagana et al., 2004; Johnson et al.,
2005].
Tableau 5 Quelques exemples de ligands naturels pouvant agir comme PE
(On remarque la présence de noyau phénolique et de deux groupements hydroxyles)
17-ȕ Estradiol
Génistéine
Į-Zéaralanol
Les phyto-estrogènes, tels que la génistéine ou la daizéine, sont des molécules naturellement
présentes dans diverses variétés de plantes, notamment le soja, les graines de lin et certaines
légumineuses et fruits. Les mycoestrogènes, dont principalement la zéaralénone, sont
produites par plusieurs espèces de moisissures tels que Fusarium graminearum, où plusieurs
métabolites de la zéaralénone ont été identifiés, comme l’Į-zéaralanol ou l’Į-zéaralénol. Ces
phyto et mycoestrogènes présentent une similitude structurale plus ou moins proche avec
l’estradiol (Tableau 5) et se lient aux récepteurs des estrogènes avec une affinité de 10 (Įzéaralanol) à 1000 (génistéine) fois moins importante que l’estradiol [Kuiper-Goodman et al.,
1987; Minervini et al., 2001; Escande et al., 2006]. Certains de ces composés sont également
37
des ligands du récepteur PXR [Mnif et al., 2007] mais avec une affinité plus faible que pour
ERĮ.
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Cette catégorie de substances comprend les hormones de synthèses, des produits chimiques à
usage industriel, agricole, domestique et également certains produits pharmaceutiques et
cosmétiques.
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Ö Les Alkylphénols (AP) sont des substances chimiques non-halogénées. Ce sont des
précurseurs des alkylphénols éthoxylates (APnEO)
utilisés comme surfactants non-anioniques [Birkett and
Lester, 2003]. On les retrouve essentiellement dans les
Figure 7 Structure Nonylphénol
effluents industriels. Les APnEO ne sont pas stables
dans l’environnement et sont rapidement dégradés en
nonylphénol (Figure 7) ou octylphénol. Diverses études ont mesuré la présence d’AP dans les
eaux usées [Lagana et al., 2004; Fountoulakis et al., 2005; Gomez et al., 2007] en constatant
des concentrations élevées allant jusqu’à 440 000 ng/L (NP en mélange) en sortie de station
de traitement. Dans le milieu récepteur, on retrouve les AP à des concentrations variables
dans les eaux de surface et les sédiments [Fenet et al., 2003; Vitali et al., 2004]. Leurs
propriétés physico-chimiques (coefficient de partition octanol-eau :log Kow >3) font que ces
substances sont préférentiellement fixées sur les sédiments (pour revue [Soares et al., 2008]).
Les AP agissent sur le récepteur des estrogènes, leurs propriétés estrogéniques ont été
démontrées in vitro [Soto et al., 1991] et in vivo [Jobling et al., 1995] chez le poisson. Leur
affinité pour le récepteur est 1000 à 10 000 fois plus faible que l’E2. Plus récemment, certains
travaux ont montré que leurs effets sur le système endocrinien ne se résument pas à leur effet
estrogénique. Ils peuvent également lier le récepteur PXR [Mnif et al., 2007] et le récepteur
AR [Paris et al., 2002].
Ö Le terme « phtalate » désigne un ensemble de diesters de l’acide orthophtalique et d’alcools à
chaînes aliphatiques ou aromatiques à nombre d’atomes de carbone variant de 1 à 13. Ils sont
utilisés comme plastifiants pour améliorer la flexibilité des polymères plastiques. Ils entrent
38
dans la composition de jouets pour enfant, revêtements de sols, emballages plastiques
alimentaires … Parmi les plus utilisés figure le di-(2éthylhexyle) phtalate (DEHP). Le DEHP
a été détecté en sortie de station d’épuration [Körner et al., 1999; Nelson et al., 2007] dans les
eaux de surface et sédiments à des concentrations élevées pouvant dépasser le mg/L d’eau ou
le µg/g de sédiment [Wang et al., 2008a; Lin et al., 2009].
Les phtalates sont connus pour leur effet estrogénique, via l’activation de ER [Harris et al.,
1997; Hashimoto et al., 2000]. Cependant leur potentiel estrogénique est 107 fois plus faible
que l’E2. Certains phtalates peuvent également induire des effets antagonistes sur AR
[Takeuchi et al., 2005] et agonistes sur les PPAR [Hurst and Waxman, 2003; Feige et al.,
2007].
Ö Le terme dioxine désigne la famille de substances aromatiques tricycliques chlorés : les
dibenzodioxines polychlorées (PCDD) et les dibenzofuranes
(PCDF) dont la plus connue est la tetrachlorodibenzo-p-dioxine
(TCDD, Figure 8). Les dioxines sont produites au cours de
processus chimiques impliquant du chlore, du carbone, de
Figure 8 Structure de la TCDD
l’oxygène à température élevée. Les sources de dioxines
résultent d’activités humaines industrielles et domestiques telles que l’incinération de boues et
de déchets, la combustion et les rejets de certaines industries (sidérurgie, métaux non ferreux,
production de papier…). Les PCDD et PCDF ont été détectés dans les boues de STEP [de
Souza Pereira and Kuch, 2005; Dai et al., 2007] des sédiments de rivières [Hui et al., 2009;
Ren et al., 2009]. Ce type de substance est rarement recherché au niveau des stations de
traitement des eaux usées.
Les dioxines et furanes agissent principalement par la voie du récepteur AhR. Les dioxines
sont de puissants activateurs du récepteur. La TCDD est, pour cela, utilisée en tant que ligand
de référence (permettant d’atteindre l’activation maximale) lors de test in vitro impliquant
l’activation d’AhR. Les dioxines peuvent présenter des activités estrogéniques par
l’intermédiaire du complexe ER-AhR-ARNT comme décrit dans le chapitre précédent.
39
Ö Les PCB sont des composés aromatiques chlorés, ils constituent une
famille de 209 congénères ayant la même structure de base constituée
d’un diphényl portant de 1 à 5 atomes de chlore par groupement
Figure 9 Structure générale
des PCB
phényle (Figure 9). Les PCB ont été très utilisés à partir des années
30 principalement comme fluides isolants dans les transformateurs,
condensateurs et disjoncteurs électriques haute tension, comme fluides hydrauliques, produits
d'imprégnation du bois et du papier ou plastifiants. Depuis 1976, leur utilisation est interdite
en Europe et aux USA, (en France par le décret du 2 février 1987). Cependant, en raison de
leur forte persistance (ils sont classés parmi les polluants organiques persistants, POP), on les
retrouve dans divers compartiments environnementaux. Ils ont été mesurés en sortie de station
à des concentrations pouvant aller jusqu’à 400 ng/L [Pham and Proulx, 1997]. Dans le milieu
récepteur, ils sont détectés dans les eaux de surface et préférentiellement dans la phase
particulaire [Dimou et al., 2006].
Certains PCB sont des ligands du récepteur AhR. Leur potentiel d’activation est variable en
fonction de leur structure. Certains ont une affinité similaire à la TCDD et d’autres sont 1000
fois moins actifs. Certains PCB peuvent également activer PXR, comme le PCB 153 [Jacobs
et al., 2005], le 138, 180, 101 et 118 [Creusot et al., in press]. Il a également été montré que
les PCB pouvaient être des agonistes de ERĮ notamment le PCB 54 [Arcaro et al., 1999] et
126 [Abdelrahim et al., 2006]. D’autres, comme le PCB 42, 128 et 138, sont des antagonistes
de AR [Portigal et al., 2002]. Toutefois les effets estrogéniques et antiestrogéniques peuvent
être induites par le complexe ER-AhR-Arnt.
Les PBB sont utilisés sur tout type de surface en tant que
retardateur de flamme. Leur action permet le ralentissement ou
l’arrêt de la prise de feu par piégeage des espèces radicalaires
présentes au sein des flammes. Leur production et utilisation sont
arrêtées en Europe depuis 2004 (Directive EEC, 2003). Les plus
Figure 10 Structure du
TBBPA
utilisés ont été le tetrabromobisphénol-A (TBBPA, Figure 10),
les polybromodiphényles éthers, les polybromobiphényles et les stéréoisomères de
l’hexabromocyclododécane (HBCD). Dans la littérature, il existe peu d’information quant à
leur devenir au cours du traitement des eaux usées. Cependant en sortie de traitement, des
40
concentrations allant de 3 à 5 µg/L ont étés mesurées [Ellis et al., 2007]. Leur présence a été
detectée également dans les eaux de surface et les sédiments où leur demi-vie a été estimée à
plus de 20 années ([Arnold et al., 2008], pour revue [Watanabe and Sakai, 2003]).
Le TBBPA est connu comme étant un perturbateur de l’axe thyroïdien à travers sa liaison aux
protéines de transport d’hormones thyroïdiennes [Meerts et al., 2000]. L’HBCD active les
récepteurs ER, AR, PR et AhR [Hamers et al., 2006], ainsi que sur le récepteur PXR [Fery et
al., 2009].
Ö Les hydrocarbures aromatiques polycycliques, communément appelés HAP, sont une famille
de substances chimiques ayant au moins deux cycles aromatiques (Figure 11). Selon le
nombre de cycles, ils sont classés en HAP légers (jusqu’à trois cycles) ou lourds (au-delà de
trois cycles), et ont des caractéristiques physico-chimiques et toxicologiques très différentes.
Leurs propriétés physico-chimiques leur confèrent un log Kow (coéfficient de répartition
octanol/eau) généralement assez élevé (supérieur à 3). Ils proviennent de la combustion de
fuel fossile (carburant essence et diesel), et d’autres processus industriels comme le raffinage
de pétrole. Ils se retrouvent dans les eaux usées par ruissellement urbain [Blanchard et al.,
2004]. En fin de traitement, ils sont retrouvés à des concentrations de l’ordre du ng/L [Pham
and Proulx, 1997; Vogelsang et al., 2006]. Ils sont également présents dans les eaux de
surface, sédiments [Guo et al., 2007] et dans le milieu marin [Charlesworth et al., 2002;
Boitsov et al., 2009].
Leur potentiel perturbateur endocrinien est reconnu, il est du majoritairement à l’activation du
récepteur AhR. L’Environmental Protection Agency (EPA) aux USA a classé 16 HAP dans
une liste de substances à risques prioritaires (Figure 11). Parmi ces substances, 10 sont
capables d’activer AhR [Louiz et al., 2008].
41
Figure 11 Liste des 16 HAP dans la liste prioritaire de l’EPA
Ö Les organoétains sont des molécules organiques possédant un atome
d’étain. Le plus connu, le tributylétain (TBT, Figure 12) est utilisé en
tant qu’agent antisalissure dans les peintures de bateau. D’autres
organoétains, comme le monobutylétain (MBT) ou dibutylétain
(DBT), sont utilisés en tant qu’agents anti-moisissures dans la
fabrication d’éponge, de couches culottes, de vêtements de sport, etc.
Figure 12 Structure du TBT
Des concentrations en organoétains, (exprimées en g d’étain, Sn),
relativement importantes de l’ordre de 3 à 12 ng(Sn)/L ont été mesurées en station d’épuration
[Fent and Mueller, 2002]. Dans les effluents de station d’épuration, on observe des
concentrations élevées de l’ordre de 2,5 mg/L de TBT et 6,9 mg/L de MBT [Voulvoulis et al.,
2004]. Les organoétains sont également présents dans les eaux de surface avec des
concentrations allant de 0,5 à 71 ng(Sn)/L [Bancon-Montigny et al., 2008]. Suite à son
utilisation dans l’industrie maritime, le TBT est fréquemment détecté dans le milieu marin à
de fortes concentrations atteignant 22 µg(Sn)/g de sédiment [Mzoughi et al., 2005; Garg et al.,
2009; Giltrap et al., 2009].
L’action perturbatrice des organoétains est bien connue. Cependant, leur mode d’action est
plus controversé. Des travaux récents indiquent qu’ils activent partiellement le récepteur
42
PPARγ par l’intermédiaire de RXRĮ [Nishikawa et al., 2004; Grun et al., 2006; le Maire et
al., 2009]. Le DBT est aussi un antagoniste du récepteur GR [Gumy et al., 2008].
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Ce terme regroupe un grand nombre de substances. Nous n’en citerons ici que certaines qui
sont des perturbateurs endocriniens connus.
Ö Les hormones de synthèse sont des substances ayant été sélectionnées pour leur bonne affinité
avec les récepteurs aux estrogènes et leur stabilité. L’éthynilestradiol, présent dans la pilule
contraceptive, et la tibolone, utilisée comme hormone de remplacement lors de la ménopause,
en font partie. L’EE2 a été mesurée dans les eaux usées à des concentrations faibles,
inférieures à 4 ng/L [Lagana et al., 2004; Janex-Habibi et al., 2009]. D’autres hormones de
synthèse, généralement antagonistes d’ERĮ sont utilisées en traitement anticancéreux, comme
le tamoxifène. Le tamoxifène a été détecté dans les eaux usées et dans le milieu récepteur à
des concentrations allant jusqu’à 200 ng/L [Roberts and Thomas, 2006].
Ö !
Certaines molécules entrant dans la composition des produits de soins et des cosmétiques ont
un potentiel estrogénique. Certains écrans UV sont capables d’induire des effets in vitro
[Gomez et al., 2005; Molina-Molina et al., 2008] et in vivo [Schlumpf et al., 2001; Schlumpf
et al., 2004]. Parmi les plus actifs on compte le 4-méthylbenzylidènecamphor (4MBC), les
benzophénone-1 et 2, l’homosalate et l’octocrylène.
Certains parabènes, utilisés comme conservateurs ont également un potentiel estrogénique in
vitro. C’est notamment le cas du butylparabène et du propylparabène qui peuvent donc être
considérés comme des perturbateurs endocriniens [Gomez et al., 2005].
Les écrans UV ont été détectés dans les eaux usées et dans le milieu récepteur. Dans les eaux
usées, les concentrations mesurées varient de 0,1 à 8 µg/L. Dans les eaux de surface, elles
sont de 0,1 à 38 ng/L [Balmer et al., 2005; Kupper et al., 2006; Plagellat et al., 2006].
43
00 +/-($!
Depuis les années 30, la production mondiale de substances chimiques a été multipliée par
400 [AFFSET, 2006]. Parmi les 100 000 substances chimiques recensées par l’union
européenne moins de 3000 ont fait l’objet d’analyses approfondies prenant en compte les
risques toxiques et écotoxiques ainsi que leur devenir (persistance, dégradation, transfert)
dans l’environnement. Le groupe de substances ayant été identifiées comme PE comprend des
familles de molécules très hétérogènes et de nature différente. L’Union Européenne a mis au
point une stratégie législative et d’évaluation des risques depuis 1996 (Tableau 6). Cette
législation a permis l’évaluation de diverses substances PE.
Depuis 2007, 20 substances reconnues PE sont soumises à des restrictions dont le NP, le di-npentylphtalate et la benzophénone-1. Entre 2005 et 2006, 27 substances ont fait l’objet
d’études sur leurs effets perturbateurs et 48 autres sont en cours d’évaluation [UE, 2007].
Parmi les substances PE ayant étés évaluées en 2005-2006, on trouve des dérivés
d’alkylphénols, la benzophénone-2, le 4MBC, la biochanine-A, le DEHP.
Tableau 6 Historique de la stratégie européenne pour les perturbateurs endocriniens
1996
Atelier Européen sur l’impact des PE sur la santé humaine et la faune.
« European Workshop on the impact of endocrine disrupters on human health and wildlife”
Définition de la notion de perturbateur endocrinien
1998
Décision du parlement européen d’améliorer la législation, la recherche et l’information du grand
public.
1999
Publication du rapport “Human and wildlife health effects of endocrine disrupting chemicals with
emphasis on wildlife and ecotoxicology test methods” par le comité scientifique de la Toxicité,
l’Ecotoxicité et l’environnement.
Dans un communiqué, la Comission invite à adopter le principe de précaution et met au point une
stratégie pour les perturbateurs endocriniens.
2000
Le parlement Européen adopte la résolution sur les perturbateurs endocriniens.
2001
Premières conclusion de la Commission
9 Etablissement d’une liste prioritaire de 553 substances à évaluer pour leur toxicité, leur présence
et persistance dans l’environnement
9 Financement de la recherche sur les PE
9 Divers projets de loi, notamment sur l’eau
2004
Deuxième rapport de la Commission
147 substances sur 553 ont été testées
Développement de la réglementation REACH (enRegistrement, Evaluation et Autorisation des
substances CHimiques)
Mise en évidence du besoin d’harmonisation des méthodes d’évaluation de la toxicité
2007
Troisième rapport de la Commission
Mise au point d’une base de données sur les 553 substances prioritaires
Adoption de la réglementation REACH (en 2006)
Participation de l’union européenne a l’OECD - Endocrine Disrupter Testing and Assessment Task
Force (EDTA) pour harmoniser les méthodes d’évaluation
Source : (UE, http://ec.europa.eu/environment/endocrine/documents/index_en.htm, le 30/08/2009)
44
La réglementation REACH (enRegistrement, Evaluation et Autorisation des substances
CHimiques) couvre le contrôle de la fabrication, de l’importation, de la mise sur le marché et
de l’utilisation des substances chimiques [MEEDAT, 2008]. REACH charge l'industrie de la
responsabilité d'évaluer et de gérer les risques posés par les produits chimiques et de fournir
des informations de sécurité adéquates à leurs utilisateurs. Le développement de cette
réglementation devrait permettre d’identifier d’autres familles de perturbateurs endocriniens,
d’en déterminer la toxicité motivant une interdiction, ou au moins une limitation de leur mise
sur le marché.
3 :
)
Que leur origine soit naturelle, anthropique ou de synthèse, les xénobiotiques sont soit
directement déversés dans le milieu aquatique, soit suivent le circuit des eaux usées où ils sont
partiellement traités pour être ensuite déversés dans le milieu récepteur. La faune aquatique
est une cible privilégiée de ce type de substances et divers effets sur ces espèces ont été
observés.
3 .. ,#&#'(&# !"#$$&#-(.(&(9&($9&
3 6;-$8#+'#+
La masculinisation des mollusques marins femelles ou « imposex » due au TBT [Gibbs and
Bryan, 1996] est un des cas les plus connus de perturbation endocrinienne provoquée par une
substance chimique présente dans l’environnement. Bien que son utilisation ait été
réglementée et fortement réduite, il est encore présent dans le milieu marin à des
concentrations atteignant 22 µg(Sn)/g de sédiment (voir I.3.1.2.1 )[Mzoughi et al., 2005; Garg
et al., 2009; Giltrap et al., 2009]. L’imposex a été observé à des concentrations de l’ordre du
ng/L dans près de 45 espèces [Ellis and Agan Pattisina, 1990] .
Le mode d’action des organoétains a beaucoup été débattu. Une des hypothèses évoquées
serait l’action du TBT sur l’aromatase, l’enzyme responsable de la conversion de la
testostérone en 17-ȕ estradiol [Heidrich et al., 2001]. Le TBT provoquerait une inhibition de
l’activité de cette enzyme et par conséquent une élévation du taux de testostérone dans
l’organisme entraînant une masculinisation. Cependant les doses auxquelles le TBT agit sur
l’aromatase sont supérieures à celles où les effets sont observés. Des études récentes ont
montré que le mode d’action des organoétains serait relayé par l’activation du récepteur
45
RXRα. Le TBT est en effet capable de se lier aux récepteurs des réxinoïdes des invertébrés
ainsi qu’à sa forme humaine. De plus, il a été observé que des réxinoïdes de synthèse sont
capables d’induire les mêmes effets que le TBT [Nishikawa et al., 2004; Grun et al., 2006; le
Maire et al., 2009]. Curieusement, alors que le TBT ne ressemble pas à des ligands de
récepteurs nucléaires, sa liaison à d’autres récepteurs nucléaires comme PPARγ [Grun et al.,
2006; Hiromori et al., 2009] et GR [Gumy et al., 2008] a également été documentée.
3% 6;-,!$!
Au début des années 90, dans des eaux de surface en Angleterre, il a été constaté une
diminution de la population de certaines espèces de poissons. La cause serait la diminution de
la population mâle et donc une difficulté de reproduction des poissons. Les rivières les plus
touchées étaient celles qui étaient réceptrices d’effluents de station d’épuration et ces effluents
furent alors suspectés d’être responsables de ces effets. En 1994, Purdom [Purdom et al.,
1994] et son équipe exposèrent des truites Arc-en-ciel en cage à la sortie de 15 stations
d’épuration
et
observèrent
une
augmentation
de
la
vitellogénine,
une
protéine
estrogénodépendante (voir Chapitre II). D’autres équipes observèrent le même phénomène
avec des truites mâles en cage placées jusqu'à 25 km en aval des effluents de station [Harries
et al., 1999]. En 1996, Routledge et Sumpter exposèrent en laboratoire des truites et des
gardons à des concentrations environnementales d’estradiol et montrèrent que l’estradiol
induisait une augmentation de l’expression de la vitellogénine [Routledge and Sumpter,
1996a].
La féminisation des poissons dans les rivières contaminées par des effluents de station est de
nos jours bien documentée. Aucune substance précise n’a été identifiée comme étant
responsable de cette perturbation mais les hormones naturelles d’origine humaine et de
synthèse (estradiol, estrone, éthynilestradiol) et les alkylphénols sont fortement suspectés
[Desbrow et al., 1998].
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A ce jour, aucune étude sur l’espèce humaine n’a abouti à une conclusion ferme quant à la
relation cause-à-effets des PE sur l’Homme. Cependant, l’implication de l’exposition aux PE
dans diverses pathologies est fortement suspectée. En voici quelques exemples.
46
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Un exemple malheureux mais très documenté de l’effet de l’exposition de PE in utero est le
cas du diéthylstilbestrol (DES).
Le DES, estrogène de synthèse non-stéroïdien, est synthétisé par Dodds et Lawson en 1937
(Dodds, 1937). Il est d'abord prescrit dans certaines grossesses à risque. En 1948, Smith
propose un traitement à base de DES en cas de risque d'avortement. Il consiste à traiter par
des cures répétées à doses progressives de la 6ème à la 35ème semaine d'aménorrhée (5 à 125
milligrammes par jour) [Smith, 1948]. Ce traitement est rapidement adopté par de nombreux
obstétriciens. En 1970 et 1971, Herbst [Herbst and Scully, 1970; Herbst et al., 1971] et son
équipe attirent l'attention sur l'incidence nettement accrue de cancer du vagin d'un type
particulier (adénocarcinome à cellules claires) chez les filles de mères ayant pris du DES lors
de leur grossesse. Ce type de cancer étant jusque là exceptionnel dans la population générale,
le retentissement a été immédiat aux Etats-Unis et la Food and Drug Administration (FDA)
interdit l'utilisation du produit pour des indications obstétricales dès 1971. Le médicament a
ensuite été progressivement interdit chez les femmes enceintes au Canada, et en Europe (en
France en 1977).
Les effets sur la descendance de femmes ayant étés traitées au DES sont maintenant
clairement identifiés. Chez les filles, outre l’adénocarcinome à cellules claires du vagin, des
malformations du col de l’utérus, de l’utérus et des trompes de Fallope ont été observées. Les
femmes exposées in utero ont plus de probabilités d’avoir des avortements spontanés, des
grossesses ectopiques et des accouchements prématurés (Steinberger et Lloyid 1985). Chez
les garçons, il a été rapporté des sous-développements ou une absence de canaux déférent, de
l’épididyme et des vésicules séminales. L’incidence de cryptorchidies et d’hypospadias
semble également être augmentée ainsi qu’une diminution du nombre de spermatozoïdes et
de la fertilité (Steinberger et Lloyid 1985).
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Développé au début de la Seconde Guerre mondiale, le DDT a été le premier insecticide
moderne. Il fut utilisé avec beaucoup de succès dans la lutte contre les moustiques
transmettant le paludisme, le typhus, ainsi que d'autres insectes vecteurs de maladies, et
également comme insecticide agricole. En 1948, le chimiste suisse Paul Hermann Müller, qui
pourtant n'est pas l'inventeur du DDT, a reçu le prix Nobel de médecine « pour sa découverte
de la grande efficacité du DDT en tant que poison contre divers arthropodes». En 1955,
47
l'OMS débuta un programme mondial d'éradication du paludisme reposant principalement sur
l'utilisation du DDT.
En 1962, la biologiste américaine Rachel Carson publia le livre «Le printemps silencieux »
(Silent Spring [Carson, 1963]) accusant le DDT d'être cancérigène et d'affecter la
reproduction des oiseaux en amincissant la coquille de leurs œufs. Ces observations
conduisent à l'interdiction de son utilisation dans de nombreux pays dans les années 1970.
Aujourd’hui le DDT est encore utilisé dans certains pays du tiers monde. Plusieurs isomères
du DDT sont estrogéniques in vitro et in vivo. Chez l’Homme, la mesure du taux de DDT
chez des jeunes femmes nées depuis 1960, a permis d’établir une corrélation étroite entre
l’exposition au DDT dans l’enfance et l’adolescence et le risque de survenue du cancer du
sein [Cohn et al., 2003; Cohn et al., 2007]. Cette étude pourrait être une première étape vers la
reconnaissance des effets perturbateurs endocriniens du DDT chez l’homme qui sont
aujourd’hui fortement suspectés mais peu reconnus.
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En 1972, un nuage de nature inconnue s’échappa d’un réacteur de l’usine chimique d’Icmesa
située prés de Meda en Italie et se répandit sur la plaine de la Lombardie. La commune la plus
touchée fut celle de Seveso. Après quatre jours, plusieurs habitants, essentiellement des
enfants, présentèrent des cas de chloracné. Dans les semaines suivantes, plusieurs animaux de
compagnie décèdèrent et les feuilles des arbres jaunissèrent. Les laboratoires HoffmannLaroche identifièrent l'agent responsable comme étant le 2,3,7,8-TCDD, ou dioxine. Il fut
prouvé que de 1 à 5 kg de dioxine furent dispersés à Seveso et l’événement fut classé comme
catastrophe environnementale.
Les effets observés après de nombreuses années sont une augmentation notable des cancers du
sein et de l’endomètre utérin [Landi et al., 1998] ainsi qu’une modification du sex-ratio (66%
de nouveaux nées de sexe féminin) [Mocarelli et al., 1996].
Cet accident a donné son nom à la directive SEVESO ou directive 96/82/CE qui impose aux
États membres de l'Union européenne d'identifier les sites industriels présentant des risques
d'accidents majeurs.
Aujourd’hui le lien entre l’exposition et les effets des perturbateurs endocriniens sur l’homme
n’a trouvé de relation causale que dans des cas d’exposition accidentelle. Dans le cas d’une
exposition continue à des concentrations environnementales faibles, la relation de cause-àeffet n’a pas encore été établie. Les obstacles de cette recherche sont l’ampleur du nombre de
48
substances à tester, et leur présence en mélange. Les études toxicologiques se sont
concentrées jusqu'à présent sur l’effet d’une molécule seule sans prendre en compte les
possibles effets additifs ou synergiques d’un mélange. Le vrai risque associé à l’exposition
aux PE ne pourra être déterminé que lors de la prise en compte des effets cumulés des
mélanges de substances.
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Le cancer du sein est l’un des cancers hormonodépendant les plus répandus chez la femme. En
France, il représente un tiers des cancers. L’incidence
de ce cancer au cours des 20 dernières années n’a fait
qu’augmenter (Figure 13). Une partie de cette
augmentation est due à l’amélioration des techniques
de dépistage ainsi qu’à des campagnes d’information
importantes. Cependant, diverses études montrent que
le dépistage et les facteurs de risques classiques
(tabac, hérédité, …) du cancer du sein ne peuvent
expliquer, à eux seuls, cette augmentation [Fenichel
and
Brucker-Davis,
2008].
Certains
facteurs
environnementaux comme l’exposition à des
Figure 13 Incidence et mortalité dues au cancer du sein
molécules à potentiel estrogénique pourraient
chez la femme de 1950 à 2006
également entrer en jeux. Dans deux études
[INVS, 2006]
d’exposition, on a observé une augmentation de la
fréquence du cancer du sein chez les femmes exposées en milieu professionnel à la TCDD
[Manz et al., 1991] ou à certains PCB [Ikeda et al., 1987]. D’autres études de cas ont cherché
à mettre en évidence une corrélation entre le cancer du sein et la présence de certains
xénoestrogènes dans le sang ou les tissus adipeux péritumoraux et ont rapporté un risque
relatif supérieur à 1 à partir d’une certaine concentration de xénoestrogènes [Aronson et al.,
2000; Cohn et al., 2007], [Fenichel and Brucker-Davis, 2008] .
L’incidence d’autres cancers hormono-dépendants est augmentée par une exposition aux PE,
c’est le cas du cancer de l’utérus, de la thyroïde, du testicule et de la prostate. Aucune donnée
pour le moment ne montre une corrélation entre l’exposition chez l’Homme et l’incidence de
ces cancers.
49
Chapitre I. Synthèse Bibliographique- II Méthodes bioanalytique de détection s des PE dans l’environnement
5
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La présence ubiquitaire de PE à des concentrations traces (allant du nano au pico gramme par
litre ou par gramme) ainsi que leur grande diversité, rend la détection de chaque molécule par
analyse chimique délicate. Les méthodes biologiques de détection, sont considérées depuis
maintenant une décennie, comme efficaces pour la détection de PE dans des échantillons
environnementaux. Elles permettent non seulement une mesure globale des substances
connues, mais également la mise en évidence de l’éventuelle présence de nouvelles molécules
actives. Dans le chapitre suivant, des méthodes de détection de PE in vitro, in cellulo et in
vivo sont présentées. L’attention est portée particulièrement sur les méthodes de détection de
ligands des récepteurs nucléaires ER et PXR ainsi que du récepteur AhR.
5
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Le principe de ce test est basé sur la liaison entre le récepteur et un ligand à tester en présence
d’un ligand connu marqué (Figure 14). Il est communément appelé « test de binding». Le
marquage peut être radioactif ou fluorescent. Ce test est effectué avec des cellules ou avec du
récepteur recombinant extrait à partir de tissus. L’échantillon est testé à différentes
concentrations dans une solution aqueuse en présence d’un ligand de réference radiomarqué
(H3 ou C14). Le mélange est incubé en présence de cellules exprimant le récepteur ou avec un
extrait de récepteur. Si l’échantillon contient des xénobiotiques capables de se lier au
récepteur, il se produit une compétition entre les molécules présentes dans l’échantillon et le
ligand radiomarqué. La séparation de la radioactivité liée et libre permet de déterminer la
quantité de ligands du récepteur présent dans l’échantillon. Cette méthode est applicable
uniquement s’il existe un ligand marqué pour le récepteur choisi.
50
Figure 14 Principe de la technique de liaison compétitive au récepteur ou "binding"
Ce test est souvent utilisé pour déterminer la constante d’affinité d’un ligand pour un
récepteur [Pillon et al., 2005; Escande et al., 2006].
Il a été développé pour la détection de ligands du récepteur ERĮ dans des échantillons
environnementaux. Il s’agit du test ERBA (Estrogen Receptor Binding Assay), [Leusch et al.,
2006a]. Ce test utilise le récepteur ERĮ, issu de l’utérus d’agnelle. A l’aide de cette méthode,
Leusch et son équipe ont mesuré la présence de ligands de ERĮ dans des eaux usées urbaines
et ont obtenu des valeurs de 51 à 73 ng/L Eq. E2. Le test de binding a l’avantage d’être rapide.
L’utilisation de récepteur en solution permet de s’affranchir des problèmes de perméabilité de
la membrane cellulaire, toxicité, réponse non spécifique, observés en cellule entière.
Cependant, le principal inconvénient de cette méthode est qu’elle ne permet pas de
discriminer la nature agoniste ou antagoniste des ligands capturés, mais seulement d’indiquer
la quantité de ligands présents. Au cours de ses travaux, Murk et al. (2002) a comparé
l’activité estrogénique, dans les eaux usées mesurée dans des modèles cellulaires (YES et
ER-CALUX) avec leur capacité à lier le récepteur ER par binding. Il a constaté que l’activité
mesurée par binding était toujours plus élevée que celle mesurée par test cellulaire ce qui
indique la présence dans l’échantillon d’un mélange d’agonistes et d’antagonistes.
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L’anisotropie de fluorescence est une méthode de mesure de l’interaction entre deux
molécules. Elle permet la mesure de l’interaction entre un récepteur, ses coactivateurs ou
corépresseurs et un ligand. La technique nécessite que l’un des trois partenaires soit marqué
par un fluorophore. Lorsque la molécule marquée n’est pas liée, le fluorophore bouge, le
signal est brouillé et la molécule irradie dans plusieurs directions (Figure 15). Lorsque le
51
complexe protéine-corégulateur-ligand se forme, le fluorophore se stabilise
et son
mouvement sera plus lent. La différence de polarisation entre l’état lié et libre, est
proportionnelle à la quantité du complexe protéine-protéine qui elle-même est proportionnelle
à la concentration des partenaires dans la solution. En analysant la courbe obtenue, il est
possible de déterminer la constante d’affinité entre les différents partenaires.
Si cette technique utilise un ligand fluorescent, on peut déterminer si cette molécule étudiée
est un ligand du récepteur. Si elle utilise un coactivateur ou corépresseur fluorescent, cette
technique permet de dire si la molécule étudiée est un agoniste ou un antagoniste.
Figure 15. Principe de l’anisotropie de fluorescence
Le marquage peut être porté par le corégulateur, le récepteur ou le ligand. La liaison stabilise le fluorophore, la lumière est
donc polarisée. La différence de polarisation entre la molécule libre et liée permet de déterminer la nature de la liaison.
L’anisotropie est habituellement utilisée pour le screening de ligands. Elle a été utilisée pour
évaluer le type de liaison entre ERĮ et certains PCB [Tavolari et al., 2006], pour évaluer
l’affinité
de
contaminants
estrogéniques
(phytoestrogènes,
hormones,
produits
pharmaceutiques) pour les récepteurs ERĮ et ERȕ [Ohno et al., 2002; Mueller et al., 2004]
ainsi que l’estrogénicité de divers métabolites de la zéaralenone [Reinen et al., 2008].
52
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Il existe des méthodes de détection in vitro basées sur des réponses enzymatiques, comme les
tests ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) et ELRA (Enzyme-Linked Receptor
Assay). Les tests ELISA utilisent la liaison à des anticorps spécifiques couplés à une enzyme.
La technique dite « en sandwich » repose sur le schéma suivant : Une surface est préparée
dans une plaque 96 puits et une quantité connue d'anticorps dirigée contre les substances
recherchées « dit anticorps de capture » y est liée. L'échantillon contenant l'antigène est
appliqué à la plaque. La plaque est ensuite rincée, de façon à éliminer les substances non-liées
à l’anticorps. Ensuite, des anticorps dirigés aussi contre les PE recherchés et conjugués à
l'enzyme sont ajoutés, la plaque est alors rincée une seconde fois. Le substrat convertible par
l'enzyme en signal fluorescent ou coloré est finalement ajouté. L’intensité de la coloration ou
la fluorescence est mesurée par dosage colorimétrique par densité optique ou par un
spectrophotomètre. Il existe aujourd’hui de nombreux test ELISA permettant de doser des
hormones, des pesticides, de nombreux produits pharmaceutiques (quelques exemples sont
cités dans le tableau 7). Le test ELRA est basé sur le même principe que le test ELISA mais
l’anticorps est remplacé par du récepteur recombinant.
Tableau 7 Exemples de tests ELISA disponibles sur le marché
Société
ALPCO Diagnostics Sale, NH
Kits ELISA
hormones (estrogénique, androgénique, thyroïdiennes, progestatifs),
phytohormones
Neogen, Life Sciences, Forensic
anabolisants,
hallucinogènes,
analgésiques,
anti-inflammatoires,
antidépresseurs…
Envirologix
insecticides, herbicides et mycotoxines
Les tests ELISA ont été utilisés avec succès pour la détection et la quantification d’hormones
et alkylphénols dans les eaux usées et dans d’autres compartiments environnementaux (eaux
de surface, sédiments et organismes marins)[Huang and Sedlak, 2001; Mart'ianov et al., 2005;
David et al., 2008; Vigano et al., 2008].
Le test ELRA a pour objectif de déterminer la présence de ligands du récepteur. Son
utilisation pour la détection de PE environnementaux est récente [Dizer et al., 2002; Mauricio
et al., 2006; Kase et al., 2008; Schrank et al., 2009]. Un des avantages de cette méthode est
qu’elle permet la détection de substances estrogéniques même dans des échantillons ayant une
forte toxicité ou un taux de salinité élevé qui pourrait brouiller la réponse des bioessais en
cellule entière [Kase et al., 2008].
53
% 5
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Le test de prolifération cellulaire a été un des premiers tests in cellulo utilisés pour la
détection de perturbateurs endocriniens estrogéniques. Il s’agit du test « E-Screen » développé
par [Soto et al., 1995]. Le principe de ce test repose sur la capacité des xéno-estrogènes à
induire la prolifération de cellules humaines issues de cancer du sein (MCF-7, ZR-75 ou T47D). Le produit à tester ou l’échantillon à doser sont ajoutés au milieu de culture des cellules
privées d’estrogènes. La présence de ligands agonistes est mise en évidence par
l’augmentation du nombre de cellules après plusieurs jours d’incubation, en comparaison avec
un témoin négatif (sans ligand) et un témoin positif (17ȕ-estradiol à concentration saturante).
Les résultats peuvent être exprimés en concentration équivalente d’estradiol (Eq. E2).
Cette méthode a été très utilisée pour le screening de ligands. Elle a permis de déterminer
l’estrogénicité du nonylphénol [Soto et al., 1991] ainsi que d’autres molécules [Sonnenschein
et al., 1995; Soto et al., 1995; Isidori et al., 2009]. Son utilisation pour la détection de PE dans
les matrices environnementales a également été développée. Cette méthode est appliquée à la
surveillance des eaux usées [Korner et al., 2000; Leusch et al., 2006b; Shappell, 2006; Nelson
et al., 2007; Tan et al., 2007; Schiliro et al., 2009], des eaux de surface [Shappell, 2006; Oh et
al., 2009] ainsi que des sédiments [Oh et al., 2000; Behnisch et al., 2001]. L’avantage de l’EScreen est sa sensibilité. Elle permet de détecter une activité estrogénique de l’ordre de 0,27
ng/L Eq. E2 dans un échantillon d’eau [Campbell et al., 2006]. Ces inconvénients sont liés à la
complexité de la réponse cellulaire. En effet, les cellules MCF-7 expriment également les
récepteurs AR, PR et GR [Horwitz et al., 1975]. L’activation de ces récepteurs peut
compromettre la validité des résultats obtenus et induire des réponses non-spécifiques.
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Ces méthodes sont basées sur la mesure de l’expression de protéines endogènes, induites par
un xénobiotique.
L’induction du gène de la vitellogénine (VTG) est fréquemment utilisée dans les espèces
aquatiques comme biomarqueur d’une exposition à des estrogènes. La VTG est une
glycolipophosphoprotéine synthétisée par le foie en réponse à une stimulation estrogénique
mais aussi androgénique [Flouriot et al., 1997; Mori et al., 1998; Segner, 1998]. Cette
protéine est le précurseur du blanc d’œuf chez les poissons ovipares. Les poissons femelles et
mâles possèdent le gène de la VTG, mais seules les femelles l’expriment après stimulation
54
estrogénique. L’expression chez le mâle ou la surexpression de ce gène chez la femelle est le
reflet d’une exposition à une substance chimique qui perturbe les fonctions endocrines. La
détection de la protéine dans le plasma est réalisée par les techniques d’ELISA ou de western
blotting. Le dosage de la VTG peut être effectué in vivo, directement sur le plasma de
l’organisme vivant exposé dans son milieu, mais également in vitro, sur cellules de poisson,
comme par exemple des hépatocytes de truite arc-en-ciel [Gagne and Blaise, 2000;
Okoumassoun et al., 2002; Navas and Segner, 2006].
Quelques études récentes ont utilisé la mesure de la vitéllogénine dans les hépatocytes de
truite arc-en ciel [Grung et al., 2007] ou d’épinoche [Bjorkblom et al., 2008] pour la détection
d’activité estrogénique dans les effluents de STEP.
L’expression des CYP1As suite à l’activation d’AhR, par certaines substances chimiques peut
être quantifiée par la mesure de l’enzyme éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD). Diverses
lignées cellulaires sont utilisées pour mesurer l’activité EROD, comme les lignées
d’hépatocarcinome du vairon du désert PHLC-1 [Hahn et al., 1996], mais également des
lignées humaines comme les HepG2, (hépatocarcinome humain) [Nakama et al., 1997] ou de
mammifère comme les H4IIE (hépatocarcinome de rat) [Willett et al., 1997]. Le test EROD a
été rarement utilisé pour la détection d’activité AhR dans les eaux usées [Ma et al., 2005],
alors que plusieurs études ont été réalisées pour le suivi de l’activité AhR dans les sédiments,
[Brack et al., 2005; Keiter et al., 2008; Otte et al., 2008; Kinani et al., 2009] et le milieu marin
[Louiz et al., 2008].
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Ces méthodes sont basées sur l’induction d’un gène rapporteur sous le contrôle de l’élément
de réponse du récepteur. Le gène rapporteur peut être introduit dans des modèles cellulaires
exprimant le récepteur de façon endogène, ou dans des modèles cellulaires où un plasmide
permet l’expression du récepteur (double transfection). Les cellules utilisées pour ce test
peuvent être des cellules humaines, des cellules animales (souris, rat, poisson) mais également
des levures.
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Le test YES (Yeast Estrogen Screen) est un test utilisant un gène rapporteur dans la levure. La
levure (Saccharomyces cerevisae) ne possède pas de récepteur nucléaire endogène. Un
système complet récepteur-gène rapporteur doit être introduit par double transfection stable.
L’équipe de [Routledge and Sumpter, 1996b] a ainsi crée un modèle exrpimant le récepteur
55
ER humain recombinant et le gène rapporteur LacZ (codant pour la ȕ-galactosidase) sous le
contrôle de ce récepteur. L’activation de ER engendre la production de la ȕ-galactosidase qui
induit la scission du substrat jaune chlorophénol-red-D-galactopyranoside présent dans le
milieu de culture le transformant en un composé rouge. La mesure de l’absorbance permet de
quantifier l’activation de ER. Les résultats sont exprimés par rapport à l’activation maximale
obtenue avec une concentration saturante en E2. L’avantage de ce modèle est la facilité de
culture de la levure qui nécessite peu d’entretien ainsi que la rapidité de la réponse.
L’inconvénient majeur est la faible sensibilité du modèle. Sa limite de détection dans des
échantillons d’eau peut varier de 0,3 à 30 ng/L Eq. E2 (contre 0,27 ng/L Eq. E2 pour l’Escreen et 0,14 ng/L Eq. E2 pour ER-CALUX) [Campbell et al., 2006]. La simplicité de ce test
fait qu’il est largement utilisé aujourd’hui pour le screening d’activité estrogénique dans les
eaux usées [Holbrook et al., 2002; Murk et al., 2002; Tilton et al., 2002; Thomas et al., 2004;
Servos et al., 2005; Nelson et al., 2007; Liscio et al., 2009], dans les eaux de surface et
sédiments [Murk et al., 2002; Pawlowski et al., 2003; Vigano et al., 2008] ainsi que dans le
milieu marin [Thomas et al., 2004; Beck et al., 2006].
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Dans ces modèles, les lignées cellulaires bioluminescentes expriment naturellement ou après
transfection le récepteur nucléaire. Elles expriment également le gène de la luciférase sous le
contrôle d’élément de réponse au récepteur. L’activation du récepteur par les substances
recherchées induit la production de luciférase qui est une enzyme capable de transformer la
luciférine (introduite dans le milieu de culture) en oxy-luciférine. La luminescence produite
est mesurée à l’aide d’un luminomètre. Les résultats de ces tests sont exprimés généralement
en pourcentage de transactivation par rapport à un ligand de référence. Nous allons présenter
les lignées cellulaires les plus utilisées pour la détection des activités ER, AhR et PXR dans
l’environnement.
II.2.3.2.1 Modèles cellulaires permettant la détection de l’activité
estrogénique
Il existe divers modèles pour la détection de l’activité estrogénique.
Le modèle ER-CALUX (Chemically Activated LUciferase eXpression) a été développé à
partir de cellules de cancer du sein T47D exprimant le récepteur ERĮ humain de façon
endogène, transfectées de manière stable avec le gène rapporteur de la luciférase, sous le
contrôle de 3 éléments de réponse au récepteur des estrogènes : ERE3-tata-Luc [Legler et al.,
56
1999]. Ce test ER-CALUX a été largement utilisé pour étudier les activités estrogéniques de
différentes substances, ou d’échantillons environnementaux (station d’épuration, eaux de
surface et sédiments) [Legler et al., 2002a; Murk et al., 2002; Bogers et al., 2007; Houtman et
al., 2007a; Houtman et al., 2007b].
La transfection stable de la luciférase dans d’autres cellules de cancer du sein, les MCF-7, a
donné lieu au test MVLN [Pons et al., 1990] puis MELN [Balaguer et al., 1999]. La lignée
MCF-7 exprime le récepteur ERĮ humain de façon endogène. Les cellules ont été transfectées
avec un gène rapporteur codant pour la luciférase sous le contrôle d’un élément de réponse du
récepteur aux estrogènes (ERE- ß Glob-Luc-SVNéo, Figure 16). La lignée MELN a été
fréquemment utilisée pour la détection de l’activité estrogénique dans les eaux usées
[Cargouet et al., 2007; Gomez et al., 2007; Hernandez-Raquet et al., 2007; Dagnino et al.,
2009; Jugan et al., 2009; Mnif et al., in press], dans les eaux de surface, les sédiments de
rivières [Fenet et al., 2003; Cargouet et al., 2004; Michallet-Ferrier et al., 2004; Pillon et al.,
2005; Kinani et al., 2009], dans les eaux souterraines [Mahjoub et al., 2009] et le milieu marin
[David et al., 2008].
Figure 16. Représentation schématique du mode de fonctionnement des lignées cellulaires MELN
D’après [Pillon, 2005]. Les xénoestrogènes introduits dans le milieu de culture se fixent sur le récepteur ERα. La fixation du
récepteur à son élément de réponse induit la transcription du gène codant pour la luciférase. La luciférase produite est dosée à
l’aide de luciférine qui se transforme en oxy-luciférine (lumineuse).
Il existe également des modèles cellulaires dans lesquelles ER n’est pas endogène mais a été
introduit dans les cellules. C’est le cas des modèles HELN-ER et U2OS-ER. Les lignées
57
HELN sont issues de la lignée de cancer de l’utérus HeLa. Elles ont été doublement
transfectées, avec le gène du récepteur humain ERĮ ou ERȕ (HELN-ERĮ et HELN-ERȕ) et le
gène rapporteur condant pour la luciférase [Escande et al., 2006]. Les lignées HELN, ont été
utilisées pour le screening de substances estrogéniques [Escande et al., 2006; Molina-Molina
et al., 2006; Molina-Molina et al., 2008].
Les lignées U2OS issues de cellules d’ostéosarcome humain, ont également été établies par
cotransfection d’un plasmide exprimant ERĮ et ERȕ et d’un plasmide rapporteur exprimant la
luciférase sous le contrôle d’un ERE [Sotoca et al., 2008]. Cette lignée a été utilisée pour le
screening de substances estrogéniques sélectives de ERĮ et ERȕ [Sotoca et al., 2008].
AhR
Différents modèles de lignées cellulaires rapporteurs ont été développés pour la détection de
l’activité AhR. Un système CALUX a été développé, il est issu de cellules tumorales
hépatiques de rats (lignée H4IIE) transfectées par le gène rapporteur luciférase sous le
contrôle d’un élément de réponse à la dioxine (XRE) [Murk et al., 1996]. Ce modèle apellé
DR-CALUX a permis la détection d’activité AhR dans les eaux de surface et sédiments dans
de nombreuses études [Behnisch et al., 2003; Hurst et al., 2004; Suzuki et al., 2004; Houtman
et al., 2006; Suzuki et al., 2006; Keiter et al., 2008; van der Linden et al., 2008; Wolz et al.,
2008] .
Pour la détection de l’activité AhR, il existe également le modèle HAhLP (Figure 17). Cette
lignée est basée sur des cellules HeLa qui expriment le récepteur AhR endogène, transfectées
avec le plasmide rapporteur XRE-TK-Luc qui contient le promoteur du gène XRE couplé au
gène rapporteur luciférase [Pillon et al., 2005].
58
Figure 17. Représentation schématique du mode de fonctionnement des lignées HAhLP
Les ligands d’AhR présents dans l’échantillon activent le récepteur AhR qui, en se fixant sur son élément de réponse XRE,
induit la transcription du gène codant pour la luciférase. La luciférase produite est dosée à l’aide de luciférine qui se
transforme en oxyluciférine (lumineuse).
La lignée HAhLP a été utilisée pour la détection d’activité AhR dans les sédiments et les eaux
de rivière [Pillon et al., 2005] ainsi qu’au cours du traitement des eaux usées [Dagnino et al.,
2009]. Ce modèle permet de déterminer si l’activité est due à des substances HAP ou dioxinelike. Les ligands d’AhR (HAP, PCB, PCDD et PCDF) induisent la production du cytochrome
CYP1A1. L’enzyme CYP1A1 agit sur la métabolisation et l’élimination de ces substances
dans la cellule. Ces réactions sont induites par toutes les molécules actives. Cependant, les
substances chlorinées (dioxines, furanes et PCB) sont métabolisées plus lentement que les
HAP [Jones et al., 2000]. Par conséquent, lors d’un temps d’incubation long, l’activité induite
par les HAP va être inférieure à celle mesurée en temps court. Inversement celle des
substances chlorinées sera stable. Par conséquent, cette différence d’activation permet, en
réalisant des dosages à deux temps d’incubation (8h/24h) de déterminer si l’activité mesurée
est due à des substances HAP-like ou à des substances dioxine-like.
La comparaison d’études utilisant des modèles cellulaires, des réponses observées (EROD ou
gène rapporteur) et des temps d’incubation différents est ainsi difficile. Dans les études
publiées dosant l’activité AhR dans des échantillons environnementaux similaires montrent
des valeurs très différentes qui ne sont donc pas comparables (voir Chapitre III).
59
PXR
Trois lignées cellulaires luminescentes, permettant la détection de l’activation du récepteur
PXR humain (hPXR), ont été établies.
Deux modèles ont étés developpés à partir des cellules de cancinomes hépatocellulaires
HepG2 , une developpée par Lemaire et al. [Lemaire et al., 2004] et une lignée commerciale
développée par Puracyp©. Un autre modèle a été developpé par notre équipe à partir de
cellules HeLa [Lemaire et al., 2006b]. La lignée HG5LNPXR a été obtenue grâce à une
double transfection. La première transfection a permis d’introduire le gène rapporteur de la
luciférase. La deuxième transfection permet l’expression d’un PXR chimère : le LBD a été
fusionné avec le DBD de GAL4 (Figure 18).
Figure 18. Représentation schématique du mode de fonctionnement des lignées HG5LNPXR
Le gène codant pour le récepteur est couplé à un domaine de liaison Gal4. Les ligands se lient au récepteur chimérique qui à
son tour se fixe à son élément de réponse Gal4RE, ce qui induit la transcription du gène codant pour la luciférase. La
luciférase produite est dosée à l’aide de luciférine qui se transforme en oxy-luciférine (lumineuse).
La détection d’activité PXR dans des échantillons environnementaux n’a été faite que dans de
rares études, dans des boues de stations d’épuration [Patureau et al., 2008], dans des eaux
usées [Mahjoub et al., 2009; Mnif et al., in press] et dans des sédiments [Kinani et al., 2009].
60
0 5
Les essais sur organisme entier sont essentiellement réalisés sur les rongeurs, les amphibiens,
les poissons, les oiseaux et les insectes. Les tests sur rongeurs sont généralement effectués en
laboratoire pour évaluer les effets potentiels de substances choisies (effet sur la reproduction,
malformations, désordre métabolique). Ces tests renseignent sur la dangerosité d’une
substance pour l’organisme vivant.
Pour le suivi des PE dans les milieux aquatiques,
l’utilisation d’un modèle, utilisant les poissons, est souvent pratiquée. Le poisson est
considéré comme un des organismes les plus à risque pour l’exposition aux perturbateurs
endocriniens. Le milieu aquatique est le réceptacle de décharges d’eaux usées et de
déversements industriels. Le poisson se retrouve donc directement exposé aux contaminants
présents dans son milieu. De plus, le déterminisme sexuel chez le poisson téléostéen est labile
et peut être perturbé par la présence d’hormones dans le milieu, au cours des étapes critiques
du développement [Francis, 1992]. Il existe un bon nombre de tests utilisant le poisson. Les
espèces utilisées le plus fréquemment sont des petits poissons, nécessitant peu d’entretien,
permettant l’utilisation en aquarium et ayant des cycles de reproduction rapides (Tableau 8)
[Scholz and Mayer, 2008].
Tableau 8 Modèles de poissons couramment utilisés pour la détection de PE dans l'eau
Nom commun
Espèce
Références
Vairon du désert
Pimephales promelas
[Panter et al., 2004; Ankley and Villeneuve, 2006]
Poisson zèbre
Danio rerio
[Nagel, 2002; Coverdale et al., 2004; Goldsmith, 2004; Hill et
al., 2005]
Medaka
Oryzias latipes
[Matsuda et al., 2002; Nanda et al., 2002]
Epinoche
Gasterosteus aculeatus
[Peichel et al., 2004; Maunder et al., 2007; Sanchez et al., 2008]
Ces modèles ont été utilisés pour l'évaluation du potentiel endocrinien de diverses substances
[Knörr and Braunbeck, 2002; Legler et al., 2002b; Micael et al., 2007; Warner and Jenkins,
2007; Sanchez et al., 2008], pour le suivi de contaminations d’effluents de stations de
traitement des eaux usées [Routledge et al., 1998; Harries et al., 1999; Bogers et al., 2007;
Hébert et al., 2008; Zoller, 2008; Notch and Mayer, 2009]
D’autres laboratoires ont développé des modèles utilisant des larves de poissons [SassiMessai et al., 2009] ou de xénopes [Fini et al., 2007]. Ces modèles nécessitent moins
d’entretien que les modèles adultes. Leur petite taille permet une utilisation en plaques de
culture 96 puits et donc une automatisation des tests.
61
3 Dans ce chapitre, nous avons décrit quelques modèles in vitro, in cellulo et in vivo pour la
détection de PE dans des matrices environnementales, notamment les eaux usées.
Les méthodes in vitro permettent d’obtenir une information sur la quantité et l’affinité de
ligands pour un récepteur donné présent dans un échantillon environnemental mais ne
fournissent aucune information sur leur action agoniste ou antagoniste.
Les méthodes in cellulo, ont l’avantage d’être des méthodes rapides et automatisables qui
permettent de mesurer l’activité totale des ligands d’un récepteur donné dans un échantillon et
d’identifier leurs modes d’actions agoniste ou antagoniste. L’essai biologique permet
également de mesurer une activité due à des effets additifs ou synergiques (mélange de
plusieurs composés actifs).
Enfin, les méthodes in vivo permettent de mesurer un effet sur l’animal entier qui tiendra
compte du métabolisme et de la biodisponibilité. Un des principaux avantages des méthodes
in vivo est de donner une information sur l’impact réel des PE sur des espèces cibles. De plus,
les espèces utilisées en laboratoire sont souvent présentes naturellement sur le terrain et
peuvent servir de bioindicateur des aires contaminées. Le principal inconvénient de ces
méthodes est un protocole lourd et coûteux même si de nouveaux tests rapides et automatisés
commencent à être développés. Cependant, l’éthique encourage le choix de méthodes in vitro
ou in cellulo par rapport aux méthodes in vivo au profit du bien être de l’animal.
Une des faiblesses de l’utilisation de matériel vivant est liée à la toxicité parfois induite par
des échantillons environnementaux complexes, ce qui ne permet pas toujours d’obtenir un
résultat répétable et parfaitement quantifiable. L’association de tests in vitro et de l’analyse
chimique a déjà fait ses preuves pour la détection de l’activité estrogénique et l’identification
des molécules responsables de cette activité. Cette approche a permis de déterminer que
l’activité estrogénique mesurée dans l’environnement est souvent due à la présence
d’hormones ou d’alkylphénols [Desbrow et al., 1998; Korner et al., 2001; Fenet et al., 2003;
Gomez et al., 2007; Tan et al., 2007].
Cette association permet de détecter la présence de composés actifs dans un échantillon
environnemental par bio-essais puis d’orienter l’analyse chimique afin d’identifier et de
quantifier les composés actifs.
62
4 5
5
Un aspect important des travaux de l'OCDE sur la sécurité de l'environnement concerne la
gestion des produits chimiques, compte tenu de leurs effets possibles sur la santé humaine et
l'environnement. Dans le contexte du programme sur les produits chimiques et de la
réglementation REACH, l'OCDE a mis en place un volet d'évaluation des perturbateurs
endocriniens qui vise les objectifs suivants :
9 Diffuser des informations et coordonner les activités ;
9 Elaborer de nouvelles lignes directrices pour les essais et réviser les lignes
directrices existantes visant à détecter les perturbateurs endocriniens ;
9 Harmoniser les méthodes de caractérisation des dangers et des risques.
Cette activité a été lancée à la demande des pays membres afin que les méthodes d'essai et
d'évaluation des perturbateurs endocriniens ne soient pas radicalement différentes d'un pays à
l'autre et que les résultats intra études puissent être comparables.
L’OCDE évalue actuellement 17 méthodes pour la détection de ligands des récepteurs ERĮ,
ERȕ, AR et TR dont les modèles MELN, PALM (pour le dosage de l’activité AR) et ERCALUX, ainsi que diverses techniques de binding [UE, 2007].
63
Chapitre I. Synthèse Bibliographique- III Perturbateurs endocriniens dans le cycle de l’eau urbaine
=)
Le cycle de l’eau urbaine est le sous-cycle de l’eau lié à l’activité humaine. Il comprend le
captage, la production et la distribution d’eau potable, la collecte, l’épuration et le rejet des
eaux usées et pluviales. Les eaux usées regroupent les eaux domestiques (eaux grises et
noires), les eaux industrielles provenant d’activités industrielles qui déversent leurs déchets
dans le réseau municipal ainsi que les eaux de pluies qui entraînent avec elles les polluants
issus du ruissellement urbain.
Indépendamment de l’origine des eaux urbaines résiduaires, le traitement des eaux est
indispensable et doit être adapté en fonction de la nature des eaux, du type de déversement et
de la réutilisation des eaux en aval, afin de :
9 Protéger les milieux récepteurs de la pollution organique provenant des eaux usées,
9 Ecarter les risques de contamination pour la santé publique de la localité,
9 Produire des effluents potentiellement réutilisables.
L’accroissement de la population, l’urbanisation et le développement industriel contribuent à
la diminution de la qualité de l’eau et à l’augmentation de polluants organiques à traiter.
Aujourd’hui dans le monde, une grande partie de la population n’a pas accès à un système
d’assainissement approprié (Figure 19) ce qui engendre de graves conséquences sur la santé
humaine (maladies hydriques) [OMS and UNICEF, 2000] et sur l’environnement.
Figure 19 Couverture géographique de la population ayant accès à l’assainissement
[OMS and UNICEF, 2000]
64
Dans le chapitre I, nous avons présenté la diversité des substances ayant un potentiel de
perturbateur endocrinien ainsi que leurs effets sur la faune aquatique. Le déversement
d’effluents urbains issus du traitement des eaux usées est une source de contamination du
milieu récepteur. La législation actuelle sur la qualité des eaux résiduaires rejetées dans
l’environnement se focalise essentiellement sur des paramètres quantitatifs : élimination de la
matière organique et des pathogènes, diminution des matières en suspension (MES),
dénitrification ou dégradation de phosphates. Les traiteurs d’eau et collectivités locales
prenant en compte l’élimination de micropolluants sont encore rares. Cependant la
communauté scientifique s’est beaucoup intéressée à l’élimination des perturbateurs
endocriniens dans divers systèmes de traitement.
%
)
Le système de traitement des eaux usées comprend trois étages de processus. La figure 20
retrace le schéma général de cheminement des eaux usées dans une station de traitement
classique [Metcalf and Eddy, 2004].
Eaux
brutes
Traitements primaires
Dégrillage
Déshuilage
Tamisage
Traitements secondaires
biologiques
Boues Activées, Lit bactérien,
Bioréacteur à membranes
…
Traitements tertiaires de
finition
Biofiltration, Lagunage,
Dénitrification, Désinfection
…
Boues
Secondaires
Boues Primaires
Traitement des
boues
Circuit eau
Circuit boues
Facultatif
Epandage
Compostage
Incinération
Figure 20 Représentation schématique du dispositif général de station d’épuration des eaux usées (STEP)
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Le traitement primaire comprend le dégrillage primaire (élimination des gros objets), le
tamisage, le dessablage par décantation accompagné d’un déshuilage par flottement [Metcalf
and Eddy, 2004].
65
%% #($"! ($#
Le traitement secondaire fait intervenir une étape de dégradation biologique aérobie ou
anaérobie [Metcalf and Eddy, 2004]. Le plus répandu est le procédé de traitement par boues
activées. Le principe des boues activées est d’utiliser la population bactérienne présente dans
l’eau pour dégrader la matière organique. Un apport en oxygène par aspersion ou par injection
permet de stimuler l’effet épuratoire et d’obtenir de bons rendements d’épuration avec des
temps de séjour courts. Le traitement biologique peut également être effectué avec des
systèmes de biomasse fixée comme les lits bactériens. Il s’agit d’un réacteur biologique non
submergé avec un biofilm fixé sur des roches ou plastiques. Le liquide est aspergé sur la
biomasse fixée et le traitement se fait lors de l’écoulement à travers le réacteur. Le biofilm à
la surface des roches ou du plastique, permet le développement de microorganismes
responsables de la biodégradation du substrat présent dans la phase liquide. Le lit bactérien est
généralement utilisé pour de petites installations.
Le traitement secondaire peut aussi être non biologique. Il s’agit de la précipitation par ajout
de coagulant chimique (généralement oxyde ferrique) qui agglomère la matière organique et
les MES et facilite leur dépôt. Les traitements chimiques et biologiques peuvent également
être utilisés en série pour obtenir un traitement plus poussé.
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Le traitement tertiaire n’est pas toujours pratiqué. Il s’agit d’un traitement de finition qui vise
à obtenir des eaux de meilleure qualité. Il peut être requis lorsque les eaux sont rejetées à
proximité d’une eau de baignade et nécessite donc une meilleure épuration bactériologique.
Ce sont des traitements biologiques comme le biofiltre, le traitement physique (filtre à sable,
la microfiltration, les UVs) ou la désinfection chimique (chloration, ozonation, charbon
activé) ou d’autres types de traitements extensifs (lagunes, filtres plantés…). Ces traitements
de finition peuvent se révéler efficaces, voire essentiels pour l’élimination de micropolluants
mais peuvent générer des sous-produits aussi actifs que les molécules mères.
66
0
Le traitement des eaux usées permet de contrôler le déversement des xénobiotiques dans le
milieu récepteur. Il est donc important de connaître le devenir des perturbateurs endocriniens
au cours du traitement pour limiter la contamination du milieu récepteur. Dans ce chapitre
nous aborderons la question du devenir des PE au cours du traitement des eaux usées et nous
nous focaliserons sur la mesure des activités estrogéniques, AhR et PXR lorsque cela est
possible.
0
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Les niveaux de contamination des effluents urbains (entrées de STEPs) varient en fonction du
type de population (urbaine, rurale) et des activités anthropiques présentes en amont de ces
STEP (industrie, hôpitaux). Les niveaux d’activité estrogénique peuvent varier de quelques
picogrammes à quelques centaines de nanogrammes d’équivalents estradiol (E2 Eq.) (voir
Figure 21).
L’activité estrogénique a été mesurée en entrée de station dans la majorité des pays
industrialisés. En Europe, les concentrations en entrée de station varient de 20 à 70 ng/L E2
Eq. [Korner et al., 2000; Svenson et al., 2003]. Aux USA et Australie, elles sont plus élevées
et peuvent atteindre 300 ng/L E2 Eq. [Fernandez et al., 2007; Nelson et al., 2007; Tan et al.,
2007; Fernandez et al., 2008].
Figure 21 Niveaux d’activité estrogénique des effluents urbains à travers le monde (ng/L E2 Eq.)
[Korner et al., 2000; Holbrook et al., 2002; Svenson et al., 2003; Ma et al., 2005; Servos et al., 2005; Leusch et al., 2006a; Fernandez et al.,
2007; Gomez et al., 2007; Tan et al., 2007]
67
La nature des eaux (domestique ou industrielle) n’est pas toujours renseignée dans la
littérature. Cependant, pour l’activité estrogénique, la présence d’industries en amont de la
station de traitement ne semble pas influencer significativement les activités mesurées. Les
valeurs relevées sur des affluents domestiques [Gomez et al., 2007; Nelson et al., 2007;
Dagnino et al., 2009] sont proches de celles mesurées dans des affluents composés de
mélanges domestique et industriel [Ternes et al., 1999; Korner et al., 2000; Murk et al., 2002].
Peu de données sont disponibles sur l’activité AhR en entrée de station d’épuration. Elle varie
en fonction du modèle de détection utilisé et du temps d’incubation (voir Chapitre II). A
l’aide du test EROD (72h d’incubation), des valeurs inférieures à 14 pg/L TCDD Eq. ont été
detectées [Ma et al., 2005]. Avec le test HAhLP (8h d’incubation), on observe des activités
plus importantes pouvant aller jusqu’à 72 ng/L TCDD Eq. [Dagnino et al., 2009].
0%
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Les STEP ont initialement été dimensionnées pour traiter les pollutions particulaire et
carbonée. Ce n’est que dans les deux dernières décennies qu’elles ont en été modernisées pour
pouvoir éliminer les pollutions azotée et phosphorée. Cependant, elles n’ont pas été conçues
pour traiter les micropolluants organiques tels que les perturbateurs endocriniens. Le devenir
des polluants perturbateurs endocriniens au cours du traitement est dépendant des propriétés
physico-chimiques des substances mais également du type de traitement opéré. Les données
de la littérature sur les abattements d’activités PE au cours du traitement des eaux usées ne
s’intéressent en général qu’à l’élimination de l’activité estrogénique. Le devenir de l’activité
AhR et PXR au cours du traitement est très pauvrement documenté voire inexistant. De plus,
les études mesurent l’abattement dans la phase dissoute et ne prennent pas en compte la phase
particulaire et rarement les boues. Le tableau 9 illustre les efficacités de traitement d’activité
estrogénique dans la phase dissoute dans divers types de procédés.
0%
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Les traitements primaires de décantation mécanique ou physico-chimique montrent
généralement une faible efficacité d’épuration pour l’activité estrogénique. Pouvant aller de 0
à 18% par décantation primaire [Svenson et al., 2003; Leusch et al., 2006a] et jusqu'à 56%
dans des traitements par précipitation au chlorure ferrique [Dagnino et al., 2009]. Le
traitement primaire ne suffit donc pas à éliminer l’activité estrogénique.
68
0%%
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La dégradation et la transformation biologique sont opérées en aérobie par l’oxydation
biologique dans des traitements de type boues activées et lit bactérien ou en anaérobie dans
des digesteurs. Les filières équipées d’un traitement secondaire biologique ont souvent montré
une meilleure efficacité épuratoire des substances estrogéniques [Svenson et al., 2003; Tan et
al., 2007; Dagnino et al., 2009; Janex-Habibi et al., 2009].
Tableau 9 Abattement de l'activité estrogénique dans différents procédés de traitements
EBN : élimination biologique des nutriments, dénitrification, déphosphatation, BA : Boues activées
Référence
Pays
Procédé de
Traitement
traitement
complémentaire
BA
[Svenson et al., 2003]
Suède
Lit bactérien
Test
Physico-chimique
Physico-chimique
59-89%
YES
Physico-chimique
[Korner et al., 2000]
[Fernandez et al., 2007]
Allemagne
Canada
BA
Lit bactérien
BA
[Conroy et al., 2007]
USA
[Leusch et al., 2005]
Australie
BA
[Cargouet et al., 2004]
France
BA
[Furuichi et al., 2006]
Japon
[Holbrook et al., 2002]
USA
[Jugan et al., 2009]
France
[Gomez et al., 2007]
France
[Dagnino et al., 2009]
France
[Tan et al., 2007]
Australie
Lagunage
% Abattement
33-75%
18%
EBN
Chloration
EBN
Chloration
E-Screen
YES
90%
25%
42-75%
YES
98%
EBN
ERBA
98%
Biofiltre
MELN
62-97%
Filtres plantés
MVLN
44-99%
MBR (pilote)
YES
56-64%
BA
MELN
Biofiltre
Lagunage
Lit bactérien
Digesteur Imhoff
Lagunage
Lit bactérien
BA
Digesteur Imhoff
EBN
MELN
MELN
E-Screen
98%
97%
90-95%
42%
96%
51%
90%
Les boues activées dont l’utilisation est extrêmement répandue, sont décrites comme étant très
efficaces pour l’élimination de l’estrogénicité. L’abattement par boues activées varie de 42 à
99% (Tableau 9). La combinaison des boues activées avec des traitements de type biofiltre, ou
d’élimination biologique de nutriments permet d’obtenir des pourcentages d’élimination
supérieurs à 90% (Tableau 9).
Le lit bactérien montre une efficacité variable mais en général beaucoup plus faible que les
boues activées. En combinaison avec d’autres traitements, l’efficacité du lit bactérien peut
69
aller jusqu’à 25% en rajoutant un dispositif de chloration [Fernandez et al., 2007], de 42 à
51% avec un digesteur en amont [Gomez et al., 2007; Dagnino et al., 2009] , de 33 à 75%
combiné avec une précipitation aux sels d’aluminium et jusqu’à 89% en combinaison avec
des boues activées [Svenson et al., 2003].
0%0
#($,(#-(/&(/.$-#,-(+
Le lagunage et les filtres plantés sont des traitements extensifs adaptables à de petites
communautés puisqu’ils nécessitent un grand espace et des temps de séjour longs.
Une station de lagunage consiste en une succession de bassins (de 3 à 5) de 0,40 m à 1,20 m
de profondeur dans lesquels l'eau s'écoule par gravité ou infiltration. Le principe du lagunage
est d’utiliser le pouvoir auto-épuratoire de l’eau. Le temps de séjour long favorise le
développement de microorganismes (bactéries, protozoaires, phyto et zooplanctons) qui
participent à l’épuration de l’eau. Dans la littérature, les données concernant l’efficacité des
traitements par lagunage pour l’élimination d’activité estrogénique sont peu nombreuses.
Fernandez et al. (2007) ont rapporté un taux d’élimination d’environ 43% dans un système
lagunaire composé de trois lagunes aérées en série. Servos et al. (2005) ont étudié trois
stations de traitement par lagunage. L’une permettait l’élimination totale de l’activité
estrogénique alors que pour les deux autres, les activités étaient plus élevées en sortie qu’en
entrée de station [Servos et al., 2005]. Ces résultats paraissent surprenant par rapport aux
données de la littérature et aucun élément dans ce travail ne permet d'expliquer cette
augmentation. Plus récemment, diverses études ont montré que l’efficacité de lagunes en série
pouvait aller de 90% à 96% [Gomez et al., 2007; Dagnino et al., 2009] et même jusqu’à 98%
dans des lagunes à infiltration [Conroy et al., 2007].
Les filtres plantés sont des lagunes plantées de macrophytes (roseaux, bambous, salicaires…)
où les plantes sont arrosées par l’eau usée. Ce traitement combine l’efficacité épuratoire des
microorganismes et des plantes. Il n’existe que quelques études évaluant l’efficacité des filtres
plantés pour l’élimination de l’activité estrogénique. Dans le cas de traitement d’effluents
porcins, elles montrent de très bons résultats (40 à 99% d’élimination), [Furuichi et al., 2006].
En tant que système épuratoire d’eau urbaine, on n’observe pas d’abattement [Xie et al.,
2005].
70
00
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La présence de composés PE dans les boues est déterminée par leur répartition entre la phase
dissoute et la phase particulaire au cours du traitement des eaux. Les PE peuvent se retrouver
dans les boues soit par dépôt lors de la décantation primaire ou secondaire et soit par
adsorption par la biomasse.
L’accroissement de la population et du volume d’eaux usées à traiter fait que la quantité de
boues produite par les stations d’épuration est en constante augmentation ce qui oblige les
pouvoirs publics à trouver des solutions pour en disposer. Dans l’Union Européenne, le choix
sur le devenir des boues porte souvent sur l’épandage agricole soit sous forme brute soit sous
forme de cendres après incinération. Actuellement, d’autres options sont en cours de
développement comme l’utilisation des boues pour la production de produits à valeur ajoutée
(compost). Toutefois, les boues peuvent contenir des polluants organiques en quantité non
négligeable dont des substances à potentiel endocrinien. L’épandage des boues peut alors
contribuer à la contamination des sols et des eaux souterraines par ce type de polluants.
Le devenir de l’activité estrogénique contenue dans les boues a été très peu étudié. La
littérature s’est essentiellement focalisée sur le devenir de ces substances dans la phase
dissoute. Holbrook et al. (2002) a étudié l’activité estrogénique des boues brutes et a
determiné des concentrations variant de 20 à 58 ng/g E2 Eq [Holbrook et al., 2002]. Des
valeurs plus élevées ont été mesurées allant de 199 à 203 ng/g E2 Eq [Hernandez-Raquet et
al., 2007]. Le traitement des boues par digestion anaérobie ne dégrade pas l’activité observée.
Au contraire, les niveaux d’activités estrogénique mesurés après digestion anaérobie sont
souvent supérieurs à ceux initiaux [Holbrook et al., 2002; Hernandez-Raquet et al., 2007]. La
digestion aérobie, moins utilisée, a montré des rendements variables n’aboutissant parfois à
aucune dégradation [Holbrook et al., 2002], et parfois à une diminution de 90% de l’activité
estrogénique mesurée [Hernandez-Raquet et al., 2007]. L’activité estrogénique des boues est
persistante au cours du traitement de celles-ci induisant un risque toxicologique potentiel lors
de leur épandage en agriculture. Les travaux de Patureau et al. ont montré la présence
d’activité estrogénique dans du compost issus de mélange de boues pouvant aller jusqu’à 81
ng/g E2 Eq. [Patureau et al., 2008].
L’activité AhR a été peu suivie dans les boues de STEPs. De l’activité AhR a été retrouvée
dans les boues, de 32 à 69 pg/g TDCC Eq. [Zhang et al., 2009] après 24h d’incubation sur
71
modèle DR-CALUX (mesurant donc uniquement l’activité due aux composés dioxine-like), et
de 2 à 8 µg/g en 8h d’incubation sur modèle HAhLP [Patureau et al., 2008] (mesurant
l’activité des composés dioxine-like et HAP-like). Les deux études montrent une faible
corrélation entre l’activité et l’analyse chimique des PCDD, PCDF et PCB. Cependant, la
présence de divers HAP explique jusqu'à 10 % de l’activité observée. Peu d’informations sont
disponibles sur le traitement des boues. Il semble que la combinaison digestion anaérobieaérobie et anoxie soit inefficace pour l’élimination de l’activité AhR et qu’au contraire, elle
contribue à la création d’activité, probablement par transformation de produits [Zhang et al.,
2009]. Une forte activité AhR a été mesurée dans du compost obtenu à partir de boues
d’épuration. Cette activité varie de 60 ng/g TCDD Eq. [Furuichi et al., 2006] à 7µg/g TCDD
Eq. [Patureau et al., 2008]. L’activité AhR mesurée dans le compost représente un risque en
cas d’utilisation du compost pour l’épandage. En effet, ni le traitement des boues en amont, ni
la phase de compostage ne semblent permettre une dégradation des composés AhR.
L’activité PXR dans les boues n’a été mesurée qu’une seule fois et est de l’ordre de 0,03 à 0,8
µg/g SR12813 Eq. et de 0,1 à 0,4 µg/g SR12813 Eq. dans le compost final obtenu avec ces
mêmes boues [Patureau et al., 2008]. Cette étude montre que les composés type alkylphénols
et PCB ne sont pas responsables de l’activité mesurée.
La présence de diverses substances responsables des activités endocrines dans les boues et le
compost soulève des inquiétudes quant à la contamination du sol agricole et des eaux
souterraines par infiltration. L’utilisation agricole des boues est un point positif puisqu’elle
permet le recyclage de nutriments. Cependant, le risque de contamination des sols doit encore
être évalué pour des composés traces comme les perturbateurs endocriniens. Seul de rares
études se sont intéressées aux transferts de polluants des boues ou compost épandus vers les
sols, et encore moins vers les plantes. Ce manque d’information est souvent dû à des
limitations analytiques liées à la complexité de la matrice boue. Plus d’informations sont
nécessaires sur le traitement des boues. Le compostage semble être une solution permettant de
valoriser les déchets en éléments à valeur ajoutée. Cependant, le devenir de composés
organiques au cours du compostage doit être mieux évalué.
72
03
$8(&* "!($($! ..-& En sortie de traitement, les niveaux d’activité estrogénique sont variables. L’activité portée
par les effluents peut varier de quelques ng à quelques dizaines de ng d’équivalents E2 par
litre d’eau (Tableau 10) mais restent le plus souvent inférieures à 15 ng/L E2 Eq.
Certaines valeurs mesurées dans les effluents sont plus élevées, pouvant aller jusqu'à 168 ng/L
(Tableau 10). Ces écarts peuvent être dus à un traitement insuffisant ou à une forte
estrogénicité en amont dans les entrées de stations.
Tableau 10 Activités estrogéniques détectées en sortie de traitement
Pays
Activités estrogéniques
ng/L E2 Eq.
Allemagne
6
[Holbrook et al., 2002]
USA
0,5 - 11
[Svenson et al., 2003]
Suède
0,1-16,4
[Cargouet et al., 2004]
France
2 - 24
[Fernandez et al., 2007]
Canada
1 - 168
[Tan et al., 2007]
Australie
1 – 14,8
[Ma et al., 2007]
Chine
0,05 - 0,5
[Mnif et al., in press]
Tunisie
0 – 58,5
[Dagnino et al., 2009]
France
1,4 – 5,2
Référence
[Korner et al., 2001]
L’activité AhR est moins documentée dans les stations de traitement. Les niveaux d’activités
détectés dans les effluents sont variables et difficilement comparables à cause temps
d’incubation variables lors de la détection par les bioessais et les différents modèles utilisés.
Les valeurs varient de 14 pg/L [Ma et al., 2005] (EROD, 72h d’incubation) à 15,1 ng/L
TCDD Eq. [Dagnino et al., 2009] (HAhLP, 8h d’incubation).
Les effluents de station sont rejetés principalement dans les eaux de surface (rivières, fleuves,
estuaires, pleine mer) et rarement au niveau des eaux souterraines. Ils contribuent à la
contamination du milieu. Les travaux de Cargouet et al. (2004) montrent que l’estrogénicité
des eaux de la Seine est multipliée par un facteur 6 entre l’amont et l’aval du rejet d’une
STEP. Les effets induits par les effluents sont, malgré cela, minimisés lors de la décharge
dans le milieu récepteur puisqu’il subissent des phénomènes de dilution, dégradation et
adsorption sur les sédiments [Sumpter, 1998].
73
3
=
Comme nous l’avons vu dans le chapitre précédent, les stations de traitement des eaux usées
sont capables d’éliminer des perturbateurs endocriniens au cours de procédés de traitement.
Cependant, en fonction du type de traitement, des PE peuvent se retrouver à des
concentrations variables dans les effluents. Par conséquent, les eaux usées peuvent contenir
des concentrations en PE suffisantes pour induire des effets néfastes sur la faune aquatique
présente dans les eaux de surfaces réceptrices des rejets [Purdom et al., 1994; Jobling et al.,
2002] (voir Chapitre I.3.1.2).
3
!($($! (&* &#.("+ $
Les effluents de STEP sont dilués dans les eaux de surface. L’activité estrogénique des eaux
de rivière décroît donc en s’éloignant de la source (zone de rejet). L’activité mesurée par
Svenson et al. (2003) à partir de 1 à 4 km du rejet sont de l’ordre de quelques pg/L soit 1/100
des valeurs mesurées en sortie de STEP. Dans les eaux de surface, l’activité estrogénique a été
mesurée et est généralement inférieure aux activités détectées en sortie de station d’épuration.
Elles varient de 0,07 à 19,4 ng/L E2 Eq. [Körner et al., 1999; Murk et al., 2002; Cargouet et
al., 2004]. Les données disponibles dans la littérature sur l’activité AhR dans les eaux de
surfaces sont extrêmement rares. Une seule étude rapporte des valeurs mesurées dans la phase
dissoute avec des valeurs très faibles de l’ordre de 0,9 to 13,3 x 10-4 pg/L TCDD Eq. (test
EROD)[Cui et al., 2009]. Dans le milieu, les polluants organiques vont se répartir dans les
différents compartiments de la colonne d’eau, la phase dissoute et les sédiments en fonction
de leurs propriétés. Les propriétés physico-chimiques des PE vont déterminer leur répartition
entre la phase dissoute et la phase particulaire ainsi que leur persistance dans
l’environnement. Ces paramètres déterminants sont la solubilité dans l’eau, le Koc et Kow. La
solubilité dans l’eau correspond à la concentration maximale d’un soluté dans l’eau pure. Elle
va varier en fonction de paramètres physico-chimiques tels que la température, le pH, la force
ionique, ou encore la présence de matière organique dissoute, de substances humiques et de
matières en suspension. Le coefficient d’adsorption (Koc) traduit la capacité d’un composé à
s’adsorber sur les sédiments [Karickhoff, 1984]. Ce coefficient est lié au coefficient de
partage octanol/eau (Kow) qui traduit pour les polluants l’hydrophobicité d’une molécule.
Plus le Kow est élevé, plus une molécule est hydrophobe [Chiou et al., 1987] et aura tendance
à être accumulée dans la fraction lipidique d’un organisme vivant ou à s’adsorber sur les
phases solides présentes en milieux aqueux.
74
Les polluants PE présents dans les eaux de surface peuvent donc être plus ou moins transférés
dans le compartiment sédiment en fonction de leurs propriétés. Les activités estrogénique,
AhR et PXR ont été mesurées dans différents sédiments (Tableau 11).
L’activité estrogénique mesurée dans les sédiments de rivières et d’estuaires à l’aide de
différents modèles, montre des valeurs souvent inférieures à 15 ng/g E2 Eq. Les activités les
plus importantes sont observées dans les sédiments prélevés à proximité des sorties
d’effluents de STEP, ce qui indique une implication des rejets dans la contamination du
milieu.
Les niveaux d’activités AhR, comme déjà décrit précédemment, varient en fonction du
modèle utilisé et du temps d’incubation. Cependant, lors de temps d’incubations courts (6-8h),
il a été mesuré des activités importantes pouvant aller jusqu’à 312 ng/g TCDD Eq. (Tableau
11). Les activités AhR les plus importantes sont observées dans les sites contaminés par
l’activité industrielle et urbaine avoisinante. L’activité PXR dans les sédiments n’a été
mesurée qu’une seule fois (Tableau 11).
Tableau 11 Activités ERĮ et AhR detectées dans divers types de sédiments
Référence
Pays
Origine du sédiment
Activités estrogénique
ng/g E2 Eq.
[Murk et al., 2002]
Pays Bas
Eaux de surface
0,07 - 0.68
France
Eaux de surface
3,4
[Legler et al., 2003]
Pays Bas
Estuaires
0,1 – 1,2
[Hurst et al., 2004]
Angleterre
Estuaires
0,2 - 13
[Hashimoto et al., 2005]
Japon
Marin
2,07 - 12,1
France
Eaux de surface
0,2 – 6,4
Référence
Pays
Activités AhR
ng/g TCDD Eq.
[Hurst et al., 2004]
Angleterre
Estuaires
1,1 - 154
Tunisie
Marin
0,9 – 312
France
Eaux de surface
0,01 - 4
Référence
Pays
France
Eaux de surface
Activités PXR
µg/g SR12813 Eq.
0,96 - 51
75
3%
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Les ressources en eau de la planète doivent répondre à de nombreuses demandes en particulier
de la part de la population humaine. Les ressources en eau, limitées et inégalement réparties,
subissent donc une pression grandissante. La réutilisation des eaux usées traitées permet de
mobiliser une ressource complémentaire. Elle est déjà mise en pratique dans de nombreux
pays comme à Chypre, en Espagne, aux USA, en Tunisie ou encore en Israël. Les usages de
ces eaux sont variés. L’utilisation majoritaire est l’irrigation des cultures ou des espaces verts
(notamment les golfs), la recharge de nappes souterraines, l’approvisionnement en eau potable
et également des usages industriels (systèmes de refroidissements). Le risque majeur lié à la
réutilisation des eaux usées est d’ordre bactériologique. En effet, le traitement des eaux usées
doit être assez performant pour éliminer les pathogènes afin d’éviter des problèmes de
maladies hydriques. La contamination par des polluants organiques est un risque mineur mais
non négligeable pour la santé humaine et pour la contamination du milieu.
Lors de l’application d’effluents de stations d’épurations sur le sol, les PE peuvent être
retenus dans le sol ou migrer vers les compartiments aquatiques souterrains par infiltration. La
concentration d’une substance dans le sol dépend de son log Koc et de sa solubilité dans l’eau,
mais également de la teneur en carbone organique du sol. Ainsi, les sols sableux, contenant
moins de carbone organique, retiennent moins les molécules. Quelques études s’intéressent à
la contamination du sol par les perturbateurs endocriniens lors de la réutilisation des eaux
usées. L’équipe de Yu et al. (2008) ont mesuré en Chine l’activité estrogénique et AhR dans
des sols agricoles irrigués avec des eaux usées. Les auteurs mesurent une augmentation
significative de l’activité ER et AhR des sols irrigués avec de l’eau usée et aucune
augmentation sur les mêmes sols irrigués avec des eaux souterraines [Yu et al., 2008]. Ceci
indique une contamination du sol par l’eau usée. La même observation a été faite en Tunisie.
Il a été détecté des activités ER et AhR dans des eaux usées utilisées pour la recharge de
nappe et l’irrigation agricole et dans les sols exposés [Mahjoub et al., 2009]. La réutilisation
des eaux usées pose donc un problème quant à la contamination du sol par des perturbateurs
endocriniens. Il n’existe aujourd’hui que quelques rares études qui évaluent l’éventuel
transfert de polluants du sol irrigué vers la plante. Bokern et al. (1998) ont mesuré le transfert
de 4-nonylphénol (4-NP, marqué au C14) du sol à la plante en pot. L’étude a montré la
présence de 4-NP dans les racines et dans les pousses [Bokern et al., 1998]. D’autres études
ont mesuré la capacité de certaines variétés de courgettes (Cucurbita pepo) à absorber des
76
composés dioxine-like (PCB, PCDD/F) montrant que ces composés pouvaient être absorbés
par la plante et que la capacité d’absorption était dépendante des propriétés physicochimiques des substances [Inui et al., 2008].
La réutilisation des eaux usées pour la production d’eau potable pose de réelles questions de
santé humaine. La contamination dépend des performances du traitement d’eau potable.
Diverses études préconisent la réutilisation indirecte des eaux usées pour la production d’eau
potable passant par la recharge artificielle de nappes souterraines qui permet, par rapport à la
réutilisation directe, d’établir une barrière de plus aux contaminants. Cette option est déjà
utilisée dans plusieurs pays dont les USA (par exemple West Basin et Orange County). De
manière générale, la recharge de nappe se fait par épandage des eaux usées traitées. La plupart
du temps, des bassins de recharge permettent une bonne rentabilisation de l’espace et un
entretien limité [Asano and Cotruvo, 2004].
77
78
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79
80
Chapitre II
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La présence de substances à potentiel endocrinien dans l’environnement aquatique a soulevé
des préoccupations sur le rôle central occupé par la contamination issue des eaux usées
[Desbrow et al., 1998; Jobling et al., 2002]. Le traitement des eaux usées en France, a été
considérablement amélioré au cours des dernières décennies avec notamment l’introduction
de traitements biologiques. Ces améliorations ont permis d’atteindre des niveaux
réglementaires de rejet en : organismes pathogènes, matières organiques et souvent nitrates et
phosphates, permettant le maintien de l’équilibre de l’écosystème récepteur des rejets.
Cependant, diverses substances identifiées comme perturbateurs endocriniens (PE) ont été
retrouvées dans les effluents comme des hormones, des alkylphénols [Lagana et al., 2004;
Janex-Habibi et al., 2009], des HAP [Busetti et al., 2006] ainsi que divers produits
pharmaceutiques [Kim et al., 2007]. Ces substances ne sont pas prises en compte dans la
réglementation concernant les eaux usées. Les gestionnaires du secteur de l’eau sont donc
confrontés à un nouveau défi: celui d’adapter les STEP pour éliminer les micropolluants dont
font partie les estrogènes et les autres PE.
De nombreuses études se sont intéressées au devenir de l’activité estrogénique au cours du
traitement des eaux usées. Le traitement par boues activées est un des plus répandus. Pour
l’activité estrogénique, ce type de traitement a montré de bonnes efficacités d’élimination,
souvent supérieures à 80% [Svenson et al., 2003; Cargouet et al., 2007; Tan et al., 2007].
Concernant d’autres traitements biologiques comme le lit bactérien et le lagunage, les
données sur le devenir des substances estrogéniques sont plus rares. Le lit bactérien est un
filtre rocheux à travers lequel s’écoule l’eau usée, le traitement s’effectue par dégradation
biologique par le biofilm présent à la surface des roches. Ce traitement a pour caractéristique
un temps de séjour hydraulique très court (quelques heures). Il est efficace pour la dégradation
de la matière organique présente dans la phase dissoute mais beaucoup moins pour la matière
organique particulaire [Marquet et al., 1999]. Le lit bactérien est considéré comme moins
efficace que les boues activées pour l’élimination des substances estrogéniques [Svenson et
al., 2003; Fernandez et al., 2007; Gomez et al., 2007] mais il a l’avantage d’être rapide et
compact. Inversement, le lagunage est caractérisé par un temps de séjour hydraulique long
(généralement supérieur à une semaine). L’épuration se fait dans de grands bassins à l’aide
des microorganismes, phyto et zooplankton qui s’y développent. Le lagunage a généralement
81
Chapitre II
de bons rendements épuratoires pour l’activité estrogénique [Conroy et al., 2007; Gomez et
al., 2007]. Le lagunage et le lit bactérien sont des solutions intéressantes pour l’épuration des
eaux dans les petites agglomérations. Ils sont souvent choisis pour leur facilité d’entretien.
Cependant, les informations sur leur capacité à éliminer des substances à potentiel
endocrinien sont peu nombreuses. Si quelques données existent sur le devenir de substances
estrogénomimétiques, aucune étude n’est en revanche disponible sur le devenir de ligands de
AhR. Cela est également vrai pour les STEP à boues activées. Or les HAP et les PCB, qui
sont des ligands de AhR, ont été détectés dans les eaux usées [Pham and Proulx, 1997;
Blanchard et al., 2004; Busetti et al., 2006]. Il serait donc nécessaire de mieux étudier le
devenir de l’activité AhR au cours de différents types de traitements.
Dans un premier temps, l’objectif de mon travail a été de caractériser le devenir de l’activité
ER et AhR au cours de traitements non conventionnels (lit bactérien et lagunage) en
comparaison avec un traitement classique (boues activées) pour des petites agglomérations.
Ces travaux ont fait l’objet d’une publication dans le journal Desalination and Water
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Dans ce travail, trois STEPs ont été sélectionnées en fonction du traitement. La première
(WWTP1) est une station de traitement par lagunage composée de cinq lagunes en série. La
deuxième (WWTP2), combine un traitement par digesteur Imhoff, un lit bactérien et un
traitement de finition par deux lagunes. Enfin, la troisième station (WWTP3) possède deux
filières parallèles traitant les mêmes eaux usées. La première est composée d’un traitement
par boues activées, la deuxième combine boues activées et précipitation par chlorure ferrique.
Des prélèvements 24h proportionnels au flux ont été effectués au niveau des eaux d’entrée de
traitement, ainsi qu’en sortie de WWTP1 et WWTP3, et en sortie de lit bactérien en WWTP2.
Deux prélèvements ponctuels ont été effectués l’un en sortie de WWTP2 et l’autre après la
deuxième lagune de WWTP1.
Les activités ER et AhR de la phase dissoute ont été mesurées. Des activités ER et AhR ont
été détectées en entrée et en sortie de chacune des stations de traitement. Le calcul des
pourcentages d’abattement de l’activité entre chaque point nous a permis de préciser les
résultats suivants:
82
Chapitre II
Ö Concernant l’activité estrogénique,
¾ Le lagunage est un traitement aussi efficace que les boues activées. Dans le
lagunage, l’abattement de l’activité se fait progressivement, 50% d’abattement
dans les deux premières lagunes et jusqu’à 96% pour le traitement dans sa totalité.
Le temps de séjour long pourrait contribuer à cette élimination.
¾ Le lit bactérien seul a une efficacité de seulement 51%. L’ajout d’un traitement de
finition par lagunage après le lit bactérien permet d’améliorer considérablement
l’efficacité d’élimination de l’activité estrogénique (92%).
¾ De même, l’ajout d’une étape de précipitation au chlorure ferrique améliore
l’efficacité de traitement des boues activées, 90% contre 59% pour des boues
activées seules.
Ö Pour l’activité AhR, moins de disparités inter-traitement sont observées.
¾ Le lit bactérien combiné au digesteur permet une élimination importante de
l’activité AhR (>99%) supérieure au lagunage (89%) et aux boues activées (75%).
¾ Le traitement physico-chimique n’améliore pas l’élimination de l’activité AhR par
boues activées.
¾ Une augmentation de l’activité AhR est observée dans les lagunes de finition de
WWTP2 qui suivent le lit bactérien. Elle pourrait provenir d’une contamination
aérienne par des substances telles que les HAP provenant d’une raffinerie de
pétrole avoisinante.
Ce travail a permis de déterminer la pertinence du suivi de l’activité estrogénique mais
également AhR dans les STEPs. La combinaison de deux traitements ou l’ajout d’un
traitement tertiaire de finition améliorent considérablement l’élimination de l’activité
estrogénique. L’activité AhR est présente dans la phase dissoute des eaux usées. Son
élimination est semblable pour les trois traitements avec une efficacité supérieure pour le lit
bactérien.
Cette étude a soulevé diverses questions. Nous avons mesuré les activités dans la phase
dissoute, mais qu’en est-il dans la phase particulaire ? Quelle est l’implication de la phase
particulaire dans l’élimination globale des activités mesurées ? De plus, comme nous avons
constaté une élimination des activités ER et AhR au cours du traitement, on peut se demander
si ces activités sont adsorbées par la phase particulaire.
83
Chapitre II
En effet, dans la littérature, l’activité estrogénique des eaux usées est mesurée essentiellement
dans la phase dissoute. Quelques rares études ont mesuré cette activité dans la phase
particulaire en montrant qu’elle était négligeable [Svenson et al., 2003]. Pourtant, le suivi de
substances à potentiel endocrinien comme les hormones a montré qu’une partie de ces
molécules est dégradée au cours du traitement et qu’une partie peut s’adsorber sur les
matières en suspension [Andersen et al., 2003; Braga et al., 2005]. Il a également été montré
que les alkylphénols et les HAP étaient préférentiellement retrouvés dans la phase particulaire
des eaux usées [Busetti et al., 2006; Janex-Habibi et al., 2009]. L’activité présente dans la
phase particulaire n’a jamais réellement été déterminée, et pourrait contribuer à la
contamination du milieu récepteur.
Le deuxième objectif de ce travail a été le suivi des activités ER et AhR au cours du
traitement dans les phases dissoute et particulaire. Les procédés de traitement ont été
sélectionnés en fonction de leur capacité à éliminer les matières en suspension : le lagunage,
le lit bactérien seul ainsi qu’un traitement par boues activées, combiné à un biofiltre. Ces trois
traitements ont des particularités différentes concernant l’élimination des matières en
suspension (MES). Le lagunage produit des MES en forte quantité en sortie dues à la présence
de phyto et zooplancton. En revanche, le biofiltre semble particulièrement efficace pour
l’élimination des MES et permet d’obtenir des taux en sortie très bas. Enfin, dans le lit
bactérien, dans lequel l’élimination des MES est similaire à un traitement par boues activées,
on constate une faible dégradation de la matière organique particulaire.
Ces travaux ont donné lieu à un article qui a été soumis pour publication dans le journal The
Science of the Total Environment.
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L’échantillonnage par prélèvements 24h proportionnels au flux a été réalisé sur trois
campagnes en entrée et sortie de chaque traitement. Les prélèvements ont été effectués dans la
phase dissoute et la phase particulaire. Les deux phases ont été séparées par filtration et
extraites séparément, le dosage des activités ER et AhR a été effectué sur les deux phases. Les
principaux résultats de ce travail sont :
Ö Concernant l’activité estrogénique,
¾ L’activité estrogénique est présente majoritairement dans la phase dissoute mais
également dans la phase particulaire.
84
Chapitre II
¾ L’activité estrogénique dans les MES ne varie pas significativement au cours du
traitement, le potentiel estrogénique des MES en entrée de STEP est proche de
celui des MES en sortie. Les MES en sortie de STEP les moins chargées en
ligands de ER sont celles issues du lagunage.
¾ L’élimination de l’activité estrogénique dans la phase particulaire est
essentiellement liée à l’élimination des MES. Dans le lagunage, le taux de MES en
sortie est élevé, ainsi la contribution de la phase particulaire est plus importante
malgré la faible estrogénicité des MES.
¾ La charge estrogénique portée par les MES en sortie de traitement peut représenter
un risque pour la faune aquatique et contribuer à la contamination des sédiments.
Ö Pour l’activité AhR,
¾ L’activité AhR est retrouvée dans les phases dissoute et particulaire. Dans les eaux
brutes l’activité AhR est repartie entre les deux phases. En sortie de traitement, la
répartition entre la phase dissoute et la phase particulaire varie en fonction du type
de traitement.
¾ L’activité AhR est due dans tous les échantillons, à des substances telles que les
HAP.
¾ La présence d’activité AhR dans la phase dissoute est probablement liée à la
matière organique dissoute dans l’eau.
¾ Au cours du traitement par lagunage, la charge d’activité portée par les MES
diminue, montrant une probable dégradation. Cependant, le taux élevé de MES en
sortie de traitement souligne que la contribution de la phase particulaire à l’activité
totale reste élevée.
¾ Dans le lit bactérien, l’activité portée par les MES n’est pas dégradée. La
diminution de l’activité AhR dans la phase particulaire en sortie est due
uniquement à l’élimination des MES.
¾ L’activité AhR portée par les MES dans les boues activées est partiellement
dégradée. L’élimination de l’activité AhR dans la phase particulaire est due à
l’élimination des MES et à une légère diminution de l’activité.
Ö Pour les deux activités et en considérant l’élimination globale dans les deux phases, le
traitement par lagunage est plus efficace que les boues activées et le lit bactérien. De plus,
dans tous les traitements, les MES contribuent à l’apport total de PE ligands de ER et AhR
85
Chapitre II
dans le milieu récepteur. Cet apport dépend de la capacité du système de traitement à
éliminer les MES.
En conclusion, ce travail a permis de définir l’implication de la phase particulaire dans
l’élimination des substances PE au cours du traitement des eaux usées. La phase particulaire
contribue à la contamination du milieu récepteur par des PE ligands de ER et AhR. Lors d’un
suivi d’efficacité d’élimination par des systèmes de traitement, les deux phases dissoute et
particulaire, doivent être prises en compte. De plus, l’élimination des MES dans les STEP est
un paramètre essentiel à prendre en compte pour l’amélioration de l’efficacité du traitement
des PE.
86
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91
92
Suspended solids in wastewater treatment and agonistic ERĮ and AhR
activities
Sonia Dagnino
1,2
, Elena Gomez1, Bernadette Picot1, Vincent Cavaillès2, Claude Casellas1,
Patrick Balaguer2, Hélène Fenet1*.
1
UMR 5569 Hydrosciences, Université Montpellier 1, Av. Charles Flahault, 34060 Montpellier, France.
2
IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, 34298 Montpellier, France; INSERM, U896,
34298 Montpellier, France; Université Montpellier 1, 34298 Montpellier, France; CRLC Val d’Aurelle Paul
Lamarque, 34298 Montpellier, France
Abstract
The distribution of Estrogen Receptor (ERĮ) and Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) activities
between the dissolved phase and suspended solids were investigated during wastewater
treatment. Three wastewater treatment plants with different treatment technologies: waste
stabilization ponds (WSP), trickling filters (TF) and activated sludge supplemented with a
biofilter system (ASB) were sampled. Estrogenic and AhR activities were detected in both
phases in influents and effluents. Estrogenic and AhR activities in wastewater influents
ranged from 41.8 to 79 ng/L E2 Eq. and from 37.9 to 115.5 ng/L TCDD Eq. in the dissolved
phase and from 5.5 to 88.6 ng/g E2 Eq. and from 0.015 to 0.7 µg/g TCDD Eq. in suspended
solids. For both activities, WSP showed greater or similar removal efficiency than ASB and
both were much more efficient than TF which had the lowest removal efficiencies. Moreover,
our data indicate that the efficiency of removal of ER and AhR activities from the particulate
phase was mainly due to removal of suspended solids. Indeed, ER and AhR activities were
detected in the effluent suspended solids indicating that the particulate phase, which is usually
not considered in these types of studies, contributes to environmental contamination by
endocrine disrupting compounds and should therefore be routinely assessed for a better
estimation of ER and AhR activities releasing in the environment.
Key Words: suspended solids, partitioning, endocrine disruptors, ERĮ, AhR
* Corresponding author:
FENET Hélène
Phone: +33 4 67 54 80 86; fax: +33 4 67 51 76 30. E-mail: hfenet@univ-montp1.fr
93
1. Introduction
Wastewater has often been identified as a source of endocrine disrupting compounds (EDCs).
Despite rigorous thresholds for effluent discharge have been established, EDCs are
nevertheless released in the environment after treatment. Indeed EDC such as natural and
synthetic hormones, alkylphenols (Andersen, et al., 2003; Kinani, et al., 2009; Lagana, et al.,
2004), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) (Busetti, et al., 2006; Pham and Proulx,
1997), pharmaceutical compounds (Kim, et al., 2007; Leclercq, et al., 2009) and also personal
care products (Terzic, et al., 2008) are commonly detected in wastewater at concentrations
going from micrograms to nanograms per litre. The wide structural variety of these substances
sets a limit to single-compound chemical analysis of complex matrices such as wastewater.
Therefore, sensitive and specific in vitro bioassays, which determine the presence of chemical
sharing a specific mode of action, have been developed in the last decade. One of the most
commonly used is based on the binding of estrogenic agonists to the estrogen receptor (ERĮ).
Assays based on binding to ERĮ have been used to evaluate the estrogenic activity of
environmental samples, such as wastewater effluents (Cargouet, et al., 2007; Dagnino, et al.,
2009; Gomez, et al., 2007; Nelson, et al., 2007) or river sediments (Fenet, et al., 2003; Murk,
et al., 1996; Thomas, et al., 2004). Bioassays based on the binding to Aryl Hydrocarbon
Receptor (AhR) have also been largely used to follow sediment contamination by urban
runoff and industrial waste (Balaguer, et al., 1996; Louiz, et al., 2008; Michallet-Ferrier, et al.,
2004; Pillon, et al., 2005), but rarely for evaluation of contamination by effluents of
wastewater treatment plants (Dagnino, et al., 2009; Ma, et al., 2005; Reungoat, et al., in
press). Nevertheless, ligands of AhR such as PAHs and some polychlorobiphenyls (PCBs) are
present in wastewater (Blanchard, et al., 2004; Busetti, et al., 2006; Pham and Proulx, 1997).
The evaluation of contamination by EDCs in wastewater with in vitro bioassays has been
mainly conducted with estrogenic model applied on the dissolved phase. This tool has been
successfully used to evaluate the efficiency of WWTP in estrogenic activity removal
(Dagnino, et al., 2009; Korner, et al., 2000; Macova, et al., in press; Reungoat, et al., in press
; Svenson, et al., 2003). Usually estrogenic activity is mainly attributed to hormones, which
are found in the dissolved phase (Andersen, et al., 2003; Keenan, et al., 2008). On the
contraty, others chemicals such as nonylphenols or PAHs, are mostly carried by suspended
solids (Busetti, et al., 2006; Janex-Habibi, et al., 2009).
Today, at our knowledge, little work is available, concerning estrogenic activity in wastewater
particulate phase. Svenson, et al., (2003) measured estrogenic activity in particles and found
94
it negligible. However, when following AhR active compounds, known ligands for the
receptor are usually lipophilic compounds that could partition into the particulate phase.
Therefore, both dissolved phase and suspended solids should be considered when following
wastewater contamination by EDCs and particularly more lipophilic compounds such as
PAHs.
The critical concern when studying these two phases is the separation technique used for their
separation. When estrogenic activity is measured in dissolved phase the separation has been
carried out by different methods: filtration with 20 µm filters (Svenson, et al., 2003), 0.7 µm
filters (Conroy, et al., 2007), silanized glass wool (Korner, et al., 2000) or centrifugation
(Leusch, et al., 2006). However, such techniques are not currently applied in the standard
monitoring of WWTPs. When concentration of suspended solid is measured in French
WWTPs, the separation is done by GF/C filter (1.2 µm) according to NF AFNOR (T90-105).
Thus, it is relevant to choose the same technical cutoff for screening of ERĮ and AhR
activities in suspended solids.
The aim of this study was to determine the distribution of ERĮ and AhR activities in
dissolved phase and suspended solids in influent and effluent of wastewater treatment plants.
As the characteristics of the suspended solids are dependent on the treatment process, three
wastewater treatment plants (WWTP) using different technologies (stabilization ponds,
trickling filter and activated sludge) were selected.
2. Materials and Methods
2.1 Sampling and WWTP surveyed
Three different WWTPs were chosen in the South of France based on the type of wastewater
treatment process used: waste stabilization ponds (WSP), trickling filters (TF) and activated
sludge supplemented with a biofilter system (ASB). WSP consists of a series of different
waste stabilization ponds. The first treatment unit is a deep anaerobic pond (DAP) with a
residence time of 3.5 days followed by a step-fed facultative recirculation pond (SFP) with a
residence time of 28 days and three maturation ponds (MP) with a residence time of 47 days.
TF consists of an Imhoff tank (IT) followed by a trickling filter (TF) with a total hydraulic
retention time (HRT) of 2 days. ASB consists of an activated sludge reactor (AS) followed by
a biofilter (BF). The general outline of three WWTP is illustrated in Figure 1 and their main
characteristics are reported in Table 1. Conventional wastewater parameters including
Biological Oxygen Demand (BOD5) and Suspended Solids (SS) were analyzed according to
standard methods (APHA-AWWA-WPCF, 2005). WWTP influents and effluents were
95
sampled. For each plant, liquid samples were flow proportional 24h-composite samples.
Influent and effluent samples were collected the same day regardless of the hydraulic
retention time (HRT). Sampling campaigns were performed in absence of precipitations to
avoid dilution by rain.
Figure 1. Schematic description of the three wastewater treatment plants.
WSP: waste stabilization ponds; TF: trickling filter; ASB: activated sludge with biofilter.
Table 1. Characterization of the investigated WWTP
Design
capacity
Sampling
period
Sampling
label
Flow
3
-1
(m ·d )
TF
ASB
14 600
2 000
470 000
SS
influent
influent
-1
(PE)
WSP
BOD5
-1
BOD5
SS
effluent
effluent
-1
(mg·L )
(mg·L )
(mg·L )
(mg·L-1)
12/2006
A
2538
310
381
7
306
04/2008
B
2593
270
306
46
185
09/2008
C
2133
360
374
26
246
12/2006
A
485
220
218
52
54
04/2008
B
520
230
325
31
38
06/2008
C
506
240
326
4
9
06/2007
A
68 920
217
260
12
12
04/2008
B
75 570
248
292
13
9
05/2008
C
74 820
220
270
15
8
HRT
(d)
78
2
0.5
SS: Suspended Solids, BOD: Biological Oxygen Demand, HRT: Hydraulic Retention Time; PE: population
equivalents
96
2.2 Materials
All solvents, ethyl acetate, methanol and dimethyl sulfoxide (DMSO), used during extraction
(either pesticide-grade or HPLC-grade) were obtained from Carlo Erba Reactifs (Val de
Reuil, France). Materials for cell culture were obtained from Invitrogen (CergyPontoise,France). Luciferin was purchased from Promega (Charbonnières-les-Bains, France).
17ȕ-estradiol (E2, CAS #50-28-2) was purchased from Sigma Aldrich (Saint-Quentin
Fallavier, France) and 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD, dioxin, CAS #1746-01-6)
from Promochem (Wesel, Germany). All effectors were dissolved in DMSO at 10 mM and
successive dilutions were performed in culture medium.
2.3 Extraction procedures
Wastewater samples (250 mL to 500 mL) were filtered through Whatman GF/C filters and
stored at 4°C until extraction within 48h. Samples were extracted using an LC-18 reversedphase cartridge (1g, 6 mL) provided by Alltech (Carquefou, France) conditioned with 5 mL of
methanol and 5 mL of HPLC-quality water, using the GX-271 ASPEC™ SPE extraction
system. Samples were applied at a rate of 5 mL/min. After solid-phase extraction, cartridges
were rinsed with 5 mL of HPLC-quality water. Elution was performed with 10 mL of ethyl
acetate: methanol (5:1). Extracts were then filtered through anhydrous sodium sulfate on a
glass microfiber filter and rotary evaporated to dryness at 37°C. Residues were taken up with
1 mL of methanol for bioassay. The same procedure was performed on a blank prepared with
500 mL distilled water; blanks tested by bioassay showed no activity (results not shown).
Suspended solids fixed on GF/C (1.2 µm) filters were dried at 60°C for two days before
microwave extraction using a Multiwave 3000W (Anton Paar, France) equipped with eight
liners. Briefly, suspended solids samples were extracted at 120°C at 1200W for 15 min using
30 mL of acetone-hexane (1:1, v/v) solvent mixture (Fountoulakis, et al., 2005; Villar, et al.,
2004). After extraction, supernatants were collected and residues washed with hexane (3×5
mL). Extracts were combined with supernatants and dried on anhydrous sodium sulfate before
rotary evaporation. Residues were taken up with 250 µL of DMSO. Blanks were obtained
using the same extraction procedure on clean filters and analysis by bioassay showed no
activity (results not shown). Results were expressed in g of suspended solids or liter of water
taking into account the concentration of suspended solids per liter.
97
2.4 MELN and HAhLP bioassays
2.4.1 Generation of stably transfected reporter cell lines
The stably transfected luciferase reporter cell lines MELN and HAhLP have been already
described by Pillon, et al. (2005). Briefly, the MELN cell line was obtained by transfecting
ERĮ positive breast cancer MCF-7 cells with the ERE-ȕGlob-Luc-SVNeo construct in which
the estrogen responsive element (ERE) was cloned upstream of the luciferase reporter gene
(Balaguer, et al., 1999). The HAhLP cell line, was obtained by transfecting HeLa cells with
the CYP1A1-Luc and pSG5-puro plasmids (Pillon, et al., 2005).
2.4.2 Cell culture conditions
HAhLP and MELN cells were grown in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium F12 (DMEM
F12) with phenol red supplemented with 5% of fetal calf serum (FCS) and 1% antibiotics
(penicillin / streptomycin) in a 5% CO2 humidified atmosphere at 37°C. Because of phenol
red and FCS estrogenic activity, in vitro experiments were carried out in DMEM F12 without
phenol red, supplemented with 5 % dextran-coated charcoal-treated fetal calf serum (DCC)
and 1% antibiotics (penicillin / streptomycin).
2.4.3 Luciferase assay
HAhLP cells were seeded at a density of 25 000 cells/well and MELN cells at 80 000
cells/well in 96-well white opaque tissue culture plates (Greiner, France) with 180 ȝL test
culture medium. Samples to be tested were prepared 4x ҏconcentrated in the same medium. 50
ȝL was then added per well 24 hr after seeding in HAhLP and after 72 hr in MELN cells.
Cells were incubated with the different effectors for 8 or 24 hr (HAhLP cells) and for 24h
(MELN cells). In all assays, each sample was tested at various concentrations in quadruplicate
in at least three independent experiments which always included both negative (solvent) and
positive (E2 and TCDD) controls.
At the end of the incubation time, medium was removed and replaced with phenol red-free
DMEM F12 containing 0.3 mM luciferin. Luciferin diffuses into the cell and produces a
luminescent signal that is stable from 5 min on. Results were expressed as a percentage of the
maximum luciferase activity. The maximum value, taken as 100, was obtained in the presence
of 10 nM E2 in MELN and of 10 nM TCDD in HAhLP cells. The basal activity (in the
absence of ligands) was 15% of the maximal activity in both HAhLP and MELN cells.
98
2.4.4 Data analysis
Dose response curves of samples were modeled by using GraphPad Software (version 5.0
Inc., San Diego, CA, USA) in order to obtain the EC50 or EC25 of all samples. Bioassayderived E2 and Dioxin Equivalents were determined by dividing the EC50 or EC25 of the
references (expressed in ng/L) by the EC50 or EC25 of each sample (expressed in ng/L of
water or ng/g of suspended solids).
2.4.5 Toxicity tests
HELN cell line was obtained by transfecting HeLa cells with ERE-bGlobin-Luc-SVNeo and
was used to check the specificity of the response and toxicity of all extracts. Strain culture and
bioassay was performed in the same conditions than HAhLP cell lines. This cell line contains
the same reporter gene as the bioassay cells and it is integrated at the same site in the genome.
However, its expression is not controlled by the receptors. In the absence of tested
compounds, a basal luciferase signal is expressed by the cells and any modification of this
baseline activity by a tested compound or environmental sample reveals a non-specific
activity or toxicity. For some samples a slight toxicity was observed at 0.3% concentration in
test culture medium. In that case, the sample concentration used for the bioassays did not
exceed 0.1%. For all other samples, no toxicity or non-specific activation was observed.
3. Results and discussion
3.1 ERĮ activities
The estrogenic activity measured in the dissolved phase of the three different WWTPs is
presented in Table 2. Estrogenic activity of the dissolved phase varied slightly in the influents
(41.8 to 79 ng/L E2 Eq.) whatever the plant capacity (from 2000 to 470 000 PE) suggesting a
relative stability in the source of ERĮ agonists in domestic wastewaters. These values are in
agreement with the ranges reported in the literature for domestic wastewater influents in urban
areas in developed countries (Dagnino, et al., 2009; Svenson, et al., 2003; Tan, et al., 2007).
In effluents dissolved phase, the lowest estrogenic activity was observed in WSP (0.5 ng/L E2
Eq.) followed by the one observed in ASB. These values are among the lowest reported in the
literature (Cargouet, et al., 2004; Dagnino, et al., 2009; Holbrook, et al., 2002; Svenson, et al.,
2003). The highest estrogenic activity was detected in the TF effluent (58 ng/L E2 Eq.)
revealing the low efficiency of such treatment in estrogenic activity removal in the dissolved
phase as observed by several authors (Dagnino, et al., 2009; Fernandez, et al., 2007; Gomez,
et al., 2007; Svenson, et al., 2003).
99
Suspended solids fixed on 1.2 µm filters were analyzed in order to determine the contribution
of the particulate phase to the total estrogenic activity of WWTP influents and effluents.
Estrogenic activtiy in suspended solids of the nine influents ranged from 5.5 to 88.6 ng/g E2
Eq. (Figure 2). In the effluents, ERĮ activities of suspended solids (6.2 to 99.1 ng/g E2 Eq.)
were in the same ranges than those observed in the influents.
Figure 2 Estrogenic activity of suspended solids samples expressed in ng of E2/g of suspended solids.
This unexpected remaining ERĮ activity in suspended solids could be due to a lack of
degradation. It is not excluded that a change in the partitioning of ER ligands between
dissolved and particulate phase could occur. One one hand, while dissolved ERĮ activity
decreased,
the
suspended
solids
were
removed
from
wastewater
changing
the
dissolved/particulate phase proportion in water. On the other hand, nature of ERĮ ligands can
vary during wastewater treatment as discusses by Auriol, et al., (2006). As estrogenic activity
in effluent suspended solids (expressed in ng/g) was present at the same level than in the
influent, the decrease of suspended solid contribution to the release of ERĮ activity into the
receiving water was the consequence of suspended solids removal from wastewater.
The three WWTPs presented differences in their ability to remove suspended solids.
Suspended solids removal was higher than 90 % for TF and ASB and lower than 40% in WSP
(Table 1). In stabilization pond effluents, suspended solids concentration is generally higher
than 100 mg/L due to the proliferation of micro-organisms, algae, phyto- and zooplankton
(Canovas, et al., 1996). In the present study, values of suspended solids in WSP effluent
reached 306 mg/L because of the presence of Daphnia and other microorganisms.
100
Consequently, although suspended solids from WSP carried the lowest ERĮ activity, their
contribution to total ER activity in effluent was high (80%, Figure 3). For TF and ASB, the
contribution of the particulate phase to the total estrogenic activity was lower than 10 % (3.4
% in TF and 7.9 % in ASB) (Figure 3). This reflects the fact that the contribution of the
particulate phase to the total estrogenic activity of the effluent is related to the plant’s
suspended solids removal efficiency.
Figure 3 Contribution of dissolved phase and suspended solids to the total estrogenic activity. Results
are expressed in % of total E2 Eq. ng/L of water. Values were obtained from the means of the 3
sampling campaigns.
101
102
Table 2. ERĮ activity expressed in E2 Eq. concentration per liter of water in dissolved and particulate phase samples
103
Table 3. AhR activity expressed in TCDD Eq. concentration per liter of water in dissolved and particulate phase
3.2 AhR activities
A preliminary consideration when determining AhR activities is the influence of incubation
time in activation by chlorinated compounds such as TCDD and PCBs and non chlorinated
compounds such as PAHs. AhR activation by TDCC and dioxin-like compounds is stable
from 8h to 24h incubation, whereas the activity of PAH-like compounds such as
Benzo(a)Pyrene (BaP) decreases with longer incubation times (8h activation > 24h
activation), (Jones, et al., 2000; Louiz, et al., 2008, Kinani et al. 2009, Mnif et al. in press).
This is due to degradation process in the cells that occurs rapidly for PAH-like compounds
and more gradually for dioxin-like compounds. Therefore, AhR activity was assessed in both
phases after 8h and 24h of incubation. All samples showed the same pattern: AhR activities
after 24h incubation time were lower than those detected at 8h (Figure 4). Thus, the AhR
activity measured in our samples was mainly due to PAH-like compounds as the observed
activities decreased with time. Same conclusions were found by Macova, et al., (in press) and
Reungoat, et al. (in press), were authors concluded that AhR activity in wastewater was also
due to PAH-like compounds.
Figure 4 Induction of luciferase activity by TF particulate matter samples in HAhLP cells after two
different incubation times (8h and 24h).
Few studies reported AhR activity in wastewater. Ma et al. (2005) found less than 14 pg/L
TCDD Eq. in wastewater influent by using the EROD (Ethoxyresorufin-O-deethylase) assay
in H4IIE rat hepatoma cells with 72h incubation. Unfortunately, these results could not be
directly compared to the present study as the incubation times (8h versus 72h), the cellular
type (HeLa versus H4IIE), and the response (luciferase expression versus EROD) were
different. However, using CAFLUX assay (H4IIE, 24h) Reungoat et al. (in press) found
values were in the same ranges than the one measured in this study (0.82 ng/L TCDD Eq.).
104
AhR activity found in the three studied WWTPs influents was the result of a partitioning
between the dissolved phase (39-47%) and suspended solids (53-66%), (Figure 5). The
presence of some lipophilic AhR ligands, such as PAHs or PCBs, in the dissolved phase is
enhanced by increasing the dissolved organic carbon (DOC) concentration (Döring and
Marschner, 1998; Warren, et al., 2003). DOC was found to have a significant negative
correlation with the Kd of organic pollutants (Katsoyiannis and Samara, 2007). In WWTP,
dissolved organic carbon (DOC) concentrations in the influents can reach 140 mg/L (mean of
67 mg/L), (Katsoyiannis and Samara, 2007). Alberts, et al., (1994) have shown the binding of
PAHs to sedimentary humic and fulvic acids and dissolved organic matter in river systems
with DOC concentrations of 7 to 34 mg/L. Therefore, we can reasonably expect that dissolved
organic matter might facilitate the transfer of some lipophilic AhR ligands in the dissolved
phase and that a competition occurs for PAH-like compounds in wastewater between the
dissolved phase and the suspended solids.
Figure 5 Contribution of dissolved phase and suspended solids samples to the total AhR activity.
Results are expressed in % of total TCDD Eq. ng/L of water. Values were obtained from the means of
the 3 sampling campaigns.
AhR activity (8h incubation) carried by wastewaters was in the same range (from 109 to 310
ng/L TCDD Eq.) in the influents from the three studied WWTPs (Table 3). These results
support that AhR bioassay could be adapted to quantify the presence of AhR ligands in
domestic wastewater as it was the case for ERĮ. As observed for estrogenic activity, in WSP
effluents AhR activity was carried mainly by the particulate phase (80.4% , Figure 5) despite
a decrease in AhR activity suspended solids (Figure 6). The contribution of suspended solids
to the total AhR activity is due to the high suspended solids concentration in the effluent. In
WSP, the decreased of AhR activity from influent to effluent, observed in dissolved phase and
105
suspended solids (Table 3 and Figure 6) supported the hypothesis of enhanced biodegradation
of the AhR ligands. WSP was the plant with the highest hydraulic retention time that could
contribute to low AhR activity by allowing higher biodegradation rates.
Figure 6 AhR activity of suspended solids samples expressed in ng of TCDD/g of suspended solids.
In TF and ASB effluents, AhR activity was mostly in the dissolved phase (78% ±14% and
86% ± 9%, Figure 5). In TF we measured the highest AhR activity in dissolved phase
effluents, reaching 43.7 ng/L TCDD Eq. (Table 3). In TF, AhR activity in suspended solids
increased from influent to effluent (Figure 6), indicating a possible sorption to suspended
solids from the dissolved phase. In ASB, AhR activity in dissolved phase was in the range of
11.6 to 18.7 ng/L TCDD Eq., which was higher than WSP but lower than TF (Table 3). In
suspended solids AhR activity in effluent was slightly lower than influent (Figure 6)
indicating a weak degradation of AhR compounds in suspended solids.
3.3 Removal efficiencies
When considering only the dissolved phase, the efficiency of ERĮ and AhR activity removal
(means on three sampling campaigns) was higher than 70 % in the case of WSP and ASB
(99% and 90%, respectively, for ERĮ activity and 96.5% and 73%, respectively, for AhR
activity) and lower than 45 % for TF. When considering the total activity (dissolved and
suspended solid) removal efficiencies were higher than 90 % for WSP (91.2% for ERĮ and
90.6 % for AhR activity), near to 90 % for ASB (91.2% for ERĮ and 89.6 % for AhR activity)
and lower than 65 % for TF (46% for ERĮ and 63 % for AhR activity). The efficacy of
estrogenic activity removal using different treatment processes has been largely documented
(Murk, et al., 2002; Nelson, et al., 2007; Servos, et al., 2005; Svenson, et al., 2003). On the
106
contrary, removal of AhR activity in wastewater treatment has been rarely studied. Activated
sludge seems to offer the highest capacity to eliminate estrogenic activity (Cargouet, et al.,
2004; Svenson, et al., 2003; Tan, et al., 2007) and estrogens (Janex-Habibi, et al., 2009;
Johnson, et al., 2005; Ternes, et al., 1999). Stabilization ponds, although data in the literature
are less abundant, also seem to present high estrogenic removal efficacy (Conroy, et al., 2007;
Gomez, et al., 2007; Svenson, et al., 2003). Conversely, trickling filters appear to be the less
efficient system (Gomez, et al., 2007; Svenson, et al., 2003). Particularly, TF removes less
efficiently dissolved organic matter than particulate organic matter (Bouwer, 1987; Marquet,
et al., 1999) because fixed biomass and shorter sludge retention time (SRT) result in a shorter
contact between particles and biofilm. Therefore the trickling filter system with a short
hydraulic retention time (few hours) is poorly efficient in removal of estrogenic and AhR
activities by biodegradation. Removal of AhR activity in TF in the present study was mainly
due to elimination of suspended solids.
Conclusion
•
Suspended solids contribute to the total ERĮ and AhR activities released into the
environment by WWTPs and should be considered when following these activities.
•
The amount of ERĮ and AhR activity carried by suspended solids and released into
the receiving environment depends on WWTP efficiency at removing suspended
solids.
•
After treatment using trickling filters or activated sludge, ERĮ and AhR activities are
mainly present in the dissolved phase and no or slight decrease in ERĮ or AhR activity
carried by suspended solids is observed.
•
In stabilization ponds, AhR activity carried by suspended solids was partially
eliminated from influent to effluent, although contribution of suspended solids to total
effluent ERĮ and AhR activities was strong due to high rates of suspended solids in
effluent.
Acknowledgements
This work was supported by funds from the French Research Ministry (S.D), and the
Research Network ERICHE (Evaluate and Reduce Impact of CHemistry in the Environment).
107
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113
114
Chapitre III
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"(#("+#$($! )+"6($--!8$#!(&*
Dans le chapitre précédent, nous avons mis en évidence la présence de composés actifs sur
les récepteurs ER et AhR dans les eaux usées. Des études récentes ont montré que d’autres
récepteurs pouvaient être des cibles de contaminants environnementaux. Ce sont le récepteur
AR, les récepteurs stéroïdiens GR et MR, PPARγ et également PXR.
PXR est activé par un nombre croissant de molécules environnementales comme certains
pesticides [Lemaire et al., 2006b], des PCB [Tabb et al., 2004] ainsi que des retardateurs de
flammes bromées [Pacyniak et al., 2007; Fery et al., 2009]. Parmi les ligands de PXR, certains
sont également des ligands des ER, tels que les hormones naturelles et de synthèse, les
alkylphénols et certains écrans UV [Jacobs et al., 2005; Mnif et al., 2007].
Le nombre croissant de contaminants pouvant activer PXR le désigne comme une cible
intéressante des molécules environnementales. Des travaux récents ont mis en évidence la
présence de ligands de PXR dans divers échantillons environnementaux comme les boues de
station d’épuration [Patureau et al., 2008; Mnif et al., in press] et les sédiments [Kinani et al.,
2009].
Dans le but de caractériser l’activité PXR et de déterminer la contribution des ligands
communs à PXR et ER et PXR et AhR, nous avons mis au point une méthode de purification
de ligands de ERĮ et de PXR basée sur la capture de ligands par du récepteur recombinant
(ERĮ et PXR) fixé sur sépharose. L’équipe avait déjà mis au point cette technique pour
ERĮ. Dans ce travail, la production de PXR recombinant a été mise au point et la capacité de
ce récepteur à fixer des ligands d’affinité différente (1nM à 10 µM) a été testée.
Ce trav ail a donné lieu à un article qui sera prochainement soumis pour publication dans
Environmental Science and Pollution Research.
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Les principaux résultats de ce travail sont les suivants :
Ö PXR immobilisé sur sépharose est capable de retenir les ligands ayant une affinité
«moyenne à forte » soit inférieure à 1µM. Les ligands de faible affinité ne sont pas bien
retenus par la colonne sépharose-PXR. Nous avons montré que cette technique permet de
séparer les ligands de bonne à moyenne affinité de ceux de faible affinité.
115
Chapitre III
Nous avons ensuite utilisé cette technique pour la caractérisation d’un échantillon
environnemental. Nous avons montré qu’un échantillon de sédiment de rivière, présentait des
activités ER, AhR et PXR. Nous avons déposé cet échantillon sur sépharose-ERĮ et PXR et
nous avons mesuré les différentes activités (ER, AhR et PXR) dans les fractions retenues et
non retenues sur les deux colonnes sépharose-récepteur. Ceci a permis de conclure que
Ö 67% de l’activité PXR mesurée est relayée par des ligands de PXR de moyenne à forte
affinité.
Ö 15 à 30 % de l’activité PXR est due à des ligands communs avec ER
Ö 57% de l’activité PXR est relayée par des ligands communs avec AhR
Ce travail a permis de mettre en évidence l’existence de ligands communs aux récepteurs ER,
PXR et AhR dans un échantillon de sédiment de rivière.
116
Characterization of environmental PXR ligands by coupling reporter cell lines
and PXR-affinity purification
Sonia Dagnino1,2, Marina Grimaldi1, Anne Riu4, Daniel Zalko4, Matthew Redinbo3, Sélim AitAissa4, Vincent Cavaillès1, Hélène Fenet2, Patrick Balaguer1,*.
1
IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, 34298 Montpellier, France ; INSERM, U896, 34298
Montpellier, France ; Université Montpellier 1, 34298 Montpellier, France ; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, 34298
Montpellier, France.
2
UMR 5569 Hydrosciences, Université Montpellier I, Av. Charles Flahault, 34060 Montpellier, France.
3
University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, USA.
4
UMR 1089 Xénobiotiques, INRA, F-31931 Toulouse, France.
5
Institut National de l’Environnement Industriels et des Risques (INERIS), Unité Evaluation des Risques Ecotoxicologiques,
Verneuil-en-Halatte, France.
Abstract
Many environmental endocrine disrupting compounds act as ligands for nuclear receptors.
The human Pregnane X receptor (hPXR), for instance, is activated by a variety of
environmental ligands such as steroids, pharmaceutical drugs, pesticides, alkylphenols,
polychlorinatedbiphenyls and polybromodiethylethers. Some of us have previously reported
the occurrence of hPXR ligands in environmental samples but failed to identify them. The aim
of this study was to test whether a PXR-affinity column, in which recombinant hPXR was
immobilized on solid support, could help to the identification of these chemicals. Using PXR
ligands of different affinity (10 nM < EC50 < 10 μM), we demonstrated that the PXR-affinity
column could capture medium to high affinity ligands (EC50 < 1µM). Furthermore, by using
the PXR-affinity column to analyze an environmental sample containing ERĮ, AhR and PXR
activities, we could show that i) half of the PXR activity of the sample was due to compounds
with medium to high affinity for PXR ii) PXR shared ligands with ERĮ and AhR. These
finding demonstrate that the newly developed PXR-affinity column coupled to reporter cell
lines represents a valuable tool for the characterization of the nature of PXR active
compounds and should therefore guide and facilitate their further analysis.
*Corresponding author:
Patrick Balaguer, PhD
email: patrick.balaguer@valdorel.fnclcc.fr
117
1. Introduction
Pregnane X receptor (PXR, NR1I2) also known as Steroid and Xenobiotic Receptor (SXR) or
Pregnane Activated Receptor (PAR) is a member of the nuclear receptor superfamily of
transcription factors. Activated PXR binds to gene promoters as a heterodimer with the
retinoid X receptor and induces expression of target genes such as cytochrome P450 3A
(CYP3A) (Kliewer et al., 2002). Unlike most nuclear receptors, which bind only to few
specific ligands with structural homologies, PXR can bind to a high number of structurally
diverse ligands. Virtual screening and crystallographic studies have shown that its ligand
binding domain (LBD) is characterized by a large flexible binding pocket that allows binding
to a broad panel of drugs and environmental contaminants with high to extremely low affinity
(Watkins et al., 2001; Lemaire et al., 2007; Xue et al., 2007a; Xue et al., 2007b; Benod et al.,
2008).
Due to its property to bind to a multitude of environmental xenobiotics, PXR is considered as
a xenobiotic sensor that regulates their clearance and therefore protects the body. However its
activity has been described as a “Jekyll and Hyde” (Biswas et al., 2009), “ying and yang”
(Moreau et al., 2007) or “double-edge sword” behavior (Fang and Zhang, 2009) to illustrate
its beneficial and prejudicial effects. Indeed, activation of PXR can be positive, as it
accelerates detoxification and elimination of xenobiotics. On the other hand, premature
metabolization of active compounds, such as hormones or drugs, means that the target
response will not be activated and this can lead to harmful effects or adverse interactions.
Metabolization of inactive compounds can also lead to production of active and harmful
metabolites, like in the case of methoxychlor that is converted by CYP2C11, a PXR-induced
enzyme, into phenolic estrogenic compounds (Mikamo et al., 2003). Moreover, co-regulators
can work in concert with ligands to stabilize PXR LBD and, consequently, the ligand-induced
transcriptional response can be influenced by the co-regulator’s interaction with the PXRresponsive elements (PXREs) on the promoter of target genes (Masuyama et al., 2005).
Altogether, it is difficult to conclude whether PXR activation by xenobiotics is predominantly
negative or positive, yet it is sure that PXR plays an essential role in endocrine disruption.
Indeed, together with Estrogen Receptor Į (ERĮ) and Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR),
PXR can be considered as a target receptor of environmental endocrine disruptors.
In this context, PXR activity has been detected by some of us in surface water and sediments
(Kinani et al., 2009, Creusot et al. in press) and in wastewater sludge (Patureau et al., 2008).
However, we were unable to chemically identify the ligands that mediated this activity.
118
Therefore in an attempt to explain the observed activity, we immobilized recombinant hPXR
LBD on solid support to purify its ligands from complex environmental mixtures as we
already did for environmental estrogens (Pillon et al., 2005). This approach was used
successfully to characterize environmental estrogens in water and sediment (Pillon et al.,
2005) and to identify the phytoestrogens responsible for the estrogenic activity observed in a
baby food sample (Riu et al., 2008).
As PXR ligands are extremely diverse in terms of structure and affinity, we first investigated
the capacity of the column to capture low to high affinity known PXR ligands. We then
characterized the PXR activity of a sediment sample in which ERĮ, PXR and AhR activities
have been previously detected (Kinani et al., 2009). The PXR affinity column allowed us to
demonstrate that almost half of the PXR activity in the sample was mediated by medium to
high affinity ligands and that some of them were estrogens and dioxin-like compounds.
2. Materials and Methods
2.1 Materials
All solvents (acetonitrile, methanol, dimethyl sulfoxide, n-hexane) used for extraction (either
pesticide-grade or HPLC-grade) were obtained from Carlo Erba Reactifs (Val de Reuil,
France). Cell culture reagents were obtained from Invitrogen (Cergy-Pontoise,France).
Luciferin was purchased from Promega (Charbonnieres-les-Bains, France). 17ȕ-estradiol (E2,
CAS #50-28-2), Į-Zearalanol, Pretilachlor were purchased from Sigma Aldrich (SaintQuentin Fallavier, France); SR12813 (CAS #126411-39-0) from Tebu-bio (Le Perray en
Yvelines, France) and 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD, dioxin, CAS #1746-01-6)
from
Promochem
(Wesel,
Germany).
N-(1-benzyl-1H-benzimidazol-5-yl)-2,3,4,5,6-
pentamethylbenzene-Sulfonamide (JM07) was synthesized as previously described (Benod et
al., 2008). All effectors were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 10 mM and
successive dilutions were performed in test culture medium (see below).
2.3 Sample preparation
Sediment was collected in the Réveillon River in the North of France during the summer
2004. The selected station was heavily impacted by anthropogenic pressures raising chemical
contamination. Sampling was carried out as already described by Kinani et al. (Kinani et al.,
2009).
119
Sediment samples were extracted as previously described (Kinani et al., 2008). Briefly, 5 g of
lyophilized and homogenized sediment were extracted three times with 10 mL of a
hexane/acetone (2:1, v/v) mixture by ASE (Assisted Solvent Extraction). Organic extracts
were then reduced to about 1 mL using rotary evaporation at 30 °C, evaporated to complete
dryness under a gentle nitrogen stream and reconstituted into 1 mL of DMSO for bioassay
experiments.
2.3 MELN/ HG5LN PXR/HAhLP bioassay
The stably transfected luciferase reporter cell lines were obtained as already described by
(Pillon et al., 2005; Lemaire et al., 2006). Briefly, the MELN cell line was obtained by
transfecting ERĮ-positive MCF-7 breast cancer cells with the ERE-ȕGlob-Luc-SVNeo
construct in which the estrogen responsive element (ERE) was cloned upstream of the
luciferase reporter gene (Luc) (Balaguer et al., 1999). The HAhLP cell line was obtained by
transfecting HeLa cells with the CYP1A1-Luc and pSG5-puro plasmids (Pillon et al., 2005).
Generation of the PXR reporter cell line was done in two steps (Lemaire et al., 2006). The
Gal4-responsive reporter gene was first stably transfected into HeLa cells, generating the
HG5LN parent cell line which was then transfected with the Gal4-PXR-puro plasmid to obtain
the HG5LN PXR cell line.
2.3.2 Culture conditions
HAhLP, HG5LN PXR and MELN cells were grown in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
F12 (DMEM) with phenol red, supplemented with 5% fetal calf serum (FCS) and 1%
antibiotics (penicillin / streptomycin) in a 5% CO2 humidified atmosphere at 37°C. Due to the
presence of phenol red and of FCS estrogenic activity, in vitro experiments were carried out
in DMEM F12 without phenol red, supplemented with 5 % dextran-coated charcoal-treated
FCS and 1% antibiotics (penicillin / streptomycin) (test culture medium).
HAhLP and HG5LN PXR cells were seeded at a density of 25 000 cells/well and MELN cells
at 80 000 cells/well in 96-well white opaque tissue culture plates (Greiner, France) in 180 ȝL
test culture medium. Samples to be tested were 4x ҏconcentrated in the same medium and 50
ȝL/well were added to 150 ȝL of test culture medium (1x final concentration) 24 hr (HAhLP
and HG5LN PXR cells) or 72 hr (MELN cells) after seeding. Cells were then incubated with
the compounds for 8 and 24 hr (HAhLP cells) or only 24h (MELN and HG5LN PXR cells). In
all assays, each sample was tested at various concentrations (i.e., going from 0.001 to 0.3% of
120
DMSO or 0.1 to 10% WB and EB) in quadruplicate, in at least three independent experiments
which always included both negative (solvent) and positive (E2, TCDD and SR12813)
controls. At the end of the incubation, medium was removed and replaced by phenol red-free
DMEM F12 containing 0.3 mM luciferin. Luciferin diffuses into the cell and produces a
luminescent signal that is stable from 5 min onwards. Results were expressed as a percentage
of the maximum luciferase activity. The maximum value, taken as 100, was obtained in the
presence of 10 nM E2 (MELN cells), 10 nM TCDD (HAhLP cells) and 1µM SR12813
(HG5LN PXR cells). The basal activity (in the absence of ligand) was 10% of the maximal
activity in HG5LN PXR cells and 15% in HAhLP and MELN cells.
2.3.4 Data analysis
Dose response curves of samples were modeled using GraphPad Software (version 5.0 Inc.,
San Diego, CA, USA) in order to obtain either the EC50 or EC25 of all samples. Bioassayderived E2, TCDD or SR12813 Equivalents were determined by dividing the EC50 or EC25
of the reference (expressed in ng/L) by the EC50 or EC25 of the sediment sample (expressed
in ng/g).
2.3.5 Cytotoxicity
The parent HG5LN cell line was used to check the specificity and toxicity of the organic
extracts. This cell line contains the same reporter gene, which is integrated at the same site in
the genome, as the cell lines used for the bioassay, but its expression is not controlled by the
receptors. In the absence of tested compound, a basal luciferase signal is observed in HG5LN
cells and any modification of this baseline activity by a tested compound or an environmental
sample reveals a nonspecific activity or toxicity. Toxicity was observed at 0.3% concentration
in test culture medium. Therefore, the organic extract concentration for the tests did not
exceed 0.1%.
2.4 Recombinant nuclear receptor production
The recombinant histidine-tagged ERĮ triple mutant (Cys 381, 417, 53 => Ser) was produced
as already described by (Pillon et al., 2005; Riu et al., 2008). Briefly, transformed
electrocompetent Escherichia coli BL21 DE3 cells were grown at 37°C to 0.2 optical density
(OD600nm) Then, temperature was slowly decreased to 15°C (in 3 hr), and recombinant
receptor synthesis was induced with 0.6 mM isopropylthiogalactopyranoside under agitation
for 16 hr. Final OD600nm was about 1.4. The histidine-tagged LBD of hPXR (residues Glu140Ser 434 in a pRSETA vector) (Chrencik et al., 2005) was expressed in Escherichia coli
BL21(DE3)plys cells. Cells were grown at 37°C in LB medium supplemented with 0.1 mg/ml
121
ampicillin and 0.034 mg/ml chloramphenicol until OD600nm reached about 0.1. Cells were then
incubated for 24 h at 22°C and the final OD600nm was about 3.
Both cell cultures (8 liters) were harvested by centrifugation at 8,000g for 20 min. Cell pellets
were resuspended in 100 ml lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM
imidazole) supplemented with a protease inhibitor mixture (complete mini EDTA-free tablets,
Roche Applied Science), lysed by sonication and centrifuged at 35,000 g at 4°C for 45 min.
Supernatants were stored at -70°C until use. Receptor concentration was evaluated by SDSPAGE electrophoresis.
2.5 Purification of ligands by immobilized recombinant receptor.
All experimental steps were carried out at 4°C. 10 nmol of recombinant ERĮ or hPXR (20
nmol for Pretilachlor and sediment sample) were immobilized on 500 µL Ni-NTA agarose
(Qiagen). 1 nmol of each compounds (2 nmol for Pretilachlor) and 14 µL of DMSO extract of
the sediment sample (7 nmol of SR12813 Eq. or 0.3 pmol of E2 Eq) were prepared in 500 µL
of washing buffer (WB: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM NaCl, 20% glycerol, 0.1 mg/mL
BSA, and 10 mM imidazole) and purified through the ERĮ and PXR columns. Three washings
with 500 µL WB were collected and elution was carried out four times with 500 µL of eluting
buffer (EB: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM NaCl, 20% glycerol, 0.1 mg/mL BSA, and 200
mM imidazole). All collected fractions (flow through, three washing and four elutions) were
warmed at 65°C for 5 minutes in order to precipitate all proteins and centrifuged at 10,000
rpm for 10 min. Activity in all collected fractions was determined by luciferase assay.
Activities of affinity purified JM07, SR12813 and Pretilachlor were assessed using the
HG5LN PXR cell line, whereas activity due to Į-Zearalanol and E2, which can bind both to
PXR and ERĮ, but have higher affinity for ERĮ than PXR, was assessed using MELN cells.
Activity of affinity purified sediment sample and ligands was determined in the flow trough
and three pooled washings (not retained fraction) and four pooled elution samples (retained
fraction). The loss was calculated by the difference of activity observed between the deposited
sample and the sum of all fractions. All purifications were carried out at least in triplicate and
all fractions were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis to follow the elution. The
specificity of the binding to the immobilized nuclear receptor was controlled by using
columns without immobilized hPXR or ERĮ LBD: no binding to Ni-NTA agarose was
detected and no activity was retained without receptor (data not shown).
122
3. Results and Discussion
3.1 Dose response curves of PXR activators in HG5LN PXR cells
Due to the high flexibility and promiscuity of PXR binding pocket, the binding affinity of its
ligands is far lower than for other nuclear receptors (e.g., E2 for ERĮ). EC50 values for known
ligands are between 13 and 370 000 nM (respectively for T0901317 and Phenobarbital) as
reviewed recently by di Masi et al. (di Masi et al., 2009) and most of PXR ligands are medium
to low affinity compounds. Therefore, to test the capture efficiency of the hPXR-based
affinity column, we selected five PXR ligands which have variable affinities
(10nM<EC50<10μM). Specifically, JM07, SR12813 and Pretilachlor are medium affinity
(1nM < EC50 < 1µM), whereas Į-Zearalanol and E2 are low affinity PXR ligands
(EC50>1µM).
Dose responses curves of each compound following incubation with HG5LN PXR cells are
shown in Figure 1 and their EC50 values are indicated in Table 1. Since Į-Zearalanol and E2
bind to ERĮ as well, we tested their activity also in MELN cells (EC50 in these cells are
shown in Table 1).
120
JM07
SR12813
Pretilachlor
α-Zaralanol
Estradiol
% of transactivation
100
80
60
40
20
0
10 -9
10 -8
10 -7
10 -6
10 -5
Concentration (M)
Fig 1. Dose-response curves of JM07, SR12813, Pretilachlor, Į-Zearalanol and 17ȕ Estradiol determined by
luciferase assay in HG5LN PXR cells. Results are expressed as the percentage of luciferase activity measured
per well (± SD of quadruplicates). The value obtained for 1µM SR12813 was taken as 100%. EC50 values are
shown in Table 1.
123
Table 1. PXR and ERα potency of the tested compounds
Compound
EC50 (PXR)
EC50 (ERĮ)
JM 07
10 nM (Benod et al. 2008)
nd
SR 12813
140 nM (Lemaire et al. 2006)
nd
Pretilachlor
180 nM (Lemaire et al. 2006)
nd
Į-Zearalanol
1.8 µM (Mnif et al. 2006)
17 pM
17-ȕ Estradiol
10 µM (Mnif et al. 2006)
1.6 pM (Pillon et al. 2005)
(EC50 values represent the concentration needed to produce half of the maximal induction in HG5LN PXR and MELN cells, determined
from Fig. 1 and references, nd: not detected)
The five compounds were then deposited on the hPXR-affinity column to determine its
capture efficiency. Flow through, washing and elution fractions were collected, their activity
tested by luciferase assay with HG5LN PXR and MELN cells (for Į-Zearalanol and Estradiol)
and eluted fragments were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis. The activity of
Pretilachlor was entirely recovered in the elution fractions, meaning that it efficiently bound
to the hPXR immobilized onto the column (Figure 2 and Table 2). Similar results were
obtained for JM07 and SR12813 (Table 2). Conversely, E2 activity was mostly found in the
washing fractions, indicating that E2 interacted weakly with immobilized hPXR (Figure 2 and
Table 2). Recombinant PXR-LBD was always detected in the eluted compounds (Table 2).
The binding capacity of ligands for the PXR-affinity column was thus inversely proportional
to the affinity of the compound for the receptor. As the EC50 of the compound increased, the
retaining capacity of the column was lower: SR12813 and Pretilachlor (EC50<200 nM) were
fully retained, whereas only 53% of Į-Zearalanol (EC50 1800 nM) and 18% of E2 (EC50 10
µM) were captured.
This observation was confirmed by a competition experiments in which a high/medium
affinity (20 nanomols of JM07, SR12813 or Pretilachlor) and a low affinity ligand (20
nanomols of Į-Zearalanol or E2) were purified through an affinity column to which limited
amounts of hPXR-LBD was immobilized (10 nanomols). Preferential binding of high or
medium affinity compounds to hPXR-LBD was observed (data not shown). In our conditions,
the hPXR-affinity column can retain only high to medium affinity compounds, whereas low
to extremely low affinity compounds are discarded, allowing the purification of the most
affine compounds.
124
125
recombinant PXR agarose columns. Lower panel: detection of hPXR LBD by SDS-Page electrophoresis in the different fractions. FT, flow through.
LBD by SDS-Page electrophoresis in the different fractions. (B) Upper panel: MELN cell luciferase assay to test 17ȕ Estradiol activity in the fractions obtained after purification on
PXR cell luciferase assay to test the activity of Pretilachlor in the different fractions following purification on recombinant hPXR agarose columns. Lower panel: detection of hPXR
Fig 2. Determination of retention capacity of recombinant hPXR-LBD immobilized on Ni-NTA agarose columns for ligands with different affinity for PXR. (A) Upper panel: HG5LN
Table 2. Capture efficiency in % of Ligand-Equivalent of all tested compounds.
% of Recoveries (± SD, n=3)
Compound
EC50
Not retained
Retained
Loss
JM 07
10 nM
4 (± 3.2)
80.3 (± 0.2)
15 (± 3.1)
SR 12813
140 nM
2 (± 1.7)
104.3 (± 4)
1 (± 0.1)
Pretilachlore
180 nM
1.5 (± 0.5)
109.7 (± 19.5)
2.7 (± 4.6)
Į-Zearalanol
1800 nM
12 (± 1.7)
52.5 (± 13.4)
35 (± 14)
17β Estradiol
10 000 nM
76.3 (± 3.5)
18.3 (± 16.3)
8.7 (± 11.7)
Eluted hPXRLBD
3.2 Biological activities in sediment sample
We then measured the PXR, ERĮ and AhR activities of a sediment sample, which was
previously identified as positive for these three activities (Kinani et al., 2009), by luciferase
assay using the HG5LN PXR, MELN and HAhLP cell lines (Figure 3). As expected, the
sample showed specific activity which was equivalent to 50.42 µg/g of SR12813 Eq., 1.2 ng/g
of E2 Eq. and 23.4 ng/g TCDD Eq. The finding that the sediment sample contains PXR, AhR
and ERĮ activities suggests that part of these activities could be due to ligands shared by the
three receptors.
PXR activity
ER activity
AhR activity
% of transactivation
100
80
60
40
20
0
10 -6
10 -5
10 -4
10 -3
g of sediment
Fig 3. Determination of PXR, ER and AhR activity with the HG5LN PXR, HAhLP and MELN reporter cell
lines in a sediment sample from the Réveillon River, France (dose response curves).
126
3.3 Purification of estrogenic compounds from the sediment extract
We first loaded the sediment sample on an ERĮ-affinity column. As done for the selected
ligands, binding specificity was controlled using ERĮ-free columns. Washing and eluted
fractions were respectively pooled and ERĮ, PXR and AhR activities were determined by
luciferase assay (Figure 4). In all experiments, we measured a 64% (± 4.5%) loss of total
sample following purification. As expected, all estrogenic activity was recovered in the
elution fractions (99%). Since the ERĮ-affinity column allows the capture of estrogenic
compounds with EC50 for ERĮ comprised between 0.1 nM and 300 nM (Pillon et al., 2005),
this result indicates that activation was due to medium to high affinity ERĮ ligands. PXR
activity was divided between washing (68%) and elution fractions (31%), suggesting that part
of PXR activity was mediated by ERĮ and PXR common ligands. AhR activity was
predominantly in the washing fraction (82 %), although a small percentage was detected in
the elution fraction (17%) which means that a minor part of AhR activity was due to ERĮ and
AhR common ligands. This result confirms our previous study in which we determined with
ERĮ-affinity columns that ERĮ and AhR activities were mediated by different compounds in
a sediment sample (Pillon et al., 2005).
% of recovered activity
120
ER
100
PXR
80
AhR
60
40
20
0
Not Retained
Retained
Fig 4. Measurement of the recovered PXR, ER and AhR activity following purification of the sediment sample
on ERĮ affinity column. Results are represented in % of recovered activity. Not retained: pooled washing
fractions and flow through; retained pooled elution fractions.
127
3.4 Purification of PXR ligands from the sediment extract
The sediment sample was loaded on a hPXR-affinity column and PXR, ERĮ and AhR
activities were determined in washing and eluted fractions (Figure 5). We measured a sample
loss of 65% (± 16%) in all experiments.
Only 47% of the PXR activity was in the retained fraction. This result indicates that the total
PXR activity is mediated by compounds with low to high binding affinity for the receptor. As
competition experiments realized with limited PXR have shown that ligands of high affinity
are retained better than lower affinity activators, the hPXR-affinity column must have selected
compounds of medium to high affinity (EC50 < 2 µM) which are responsible for about half of
the PXR activity. Thus this approach allowed us to separate high-medium from low affinity
PXR ligands in a complex mixture containing different types of xenobiotics and to determine
that the total PXR activity is mediated by a 50:50 mixture of medium-high to low affinity
ligands. Estrogenic activity was mostly not retained by the hPXR-affinity column (82%). This
result indicates that the recovered estrogenic activity (15%) was mediated by medium to high
affinity PXR ligands which are also ER ligands. On the other hand, 57 % of AhR activity was
retained by the hPXR-affinity column indicating that half of PXR ligands are common PXRAhR agonists. Our hPXR-affinity column thus allowed the purification of shared ERĮ, PXR
and AhR ligands and the assessment of their cross-activity. These results are in agreement
with previous works reporting that PXR has common ligands with ERĮ, such as natural and
synthetic hormones or alkylphenols (Mnif et al., 2007), as well as with AhR, such as PCBs
(Tabb et al., 2004; Jacobs et al., 2005) and polybrominated biphenyls (Chen et al., 2001;
Pacyniak et al., 2007).
% of recovered activity
120
PXR
100
ER
80
AhR
60
40
20
0
Not Retained
Retained
Fig 5. Measurement of the recovered PXR, ER and AhR activity following purification of the sediment sample
on hPXR affinity column. Results are represented in % of recovered activity. Not retained: pooled washing
fractions and flow through; retained pooled elution fractions.
128
The combination of ERĮ and PXR reporter cell lines and affinity columns, which allows the
purification and the concentration of both known and unknown ERĮ and PXR environmental
ligands prior to the investigation of their structure using LC or GC-MS, is a powerful tool to
identify nuclear receptor agonists in complex mixtures. Given the difficulty in explaining
PXR activity in environmental samples, these tools could guide the chemical analysis and
enable the identification of the active PXR ligands. Furthermore, this technique could be also
applied to emerging environmental nuclear receptors targets as androgen receptor (Kinani et
al., 2009), peroxysome proliferator activated receptor γ (Grun et al., 2006) or retinoid X
receptors (le Maire et al., 2009).
Acknowledgment
This work was supported by funds from the French Research Ministery (S.D), the Agence
Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du Travail (AFSSET, RD-2005-007 to
P.B.), the European Union Commission (CASCADE FOOD-CT-2004-506319 to P.B.) and
the research network ERICHE (Evaluate and Reduce Impact of CHemistry in the
Environment).
129
References
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134
Chapitre IV
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Dans le chapitre II, nous avons montré la présence de ligands des récepteurs ER et AhR dans
les eaux usées. Nous avons montré que les phases dissoute et particulaire contribuaient aux
activités totales mesurées et que ces deux phases devaient être prises en compte. Dans la
littérature, des études récentes ont montré que d’autres récepteurs que ER et AhR pouvaient
être cible de PE environnementaux, et notamment le récepteur PXR [Patureau et al., 2008;
Kinani et al., 2009; Mnif et al., in press]. Ce récepteur a la capacité de se lier à de nombreux
contaminants et l’identification des substances responsables de l’activité PXR est complexe.
Pour cela, dans le chapitre III nous avons développé un outil de purification des ligands
environnementaux de ERĮ et PXR. Le travail récent de notre équipe [Mnif et al., in press,
voir Annexe], a montré que l’activité PXR pouvait également être mesurée dans les STEP.
Actuellement, les travaux sur les PE dans les eaux usées, disponibles dans la littérature,
utilisent des techniques d’analyse chimique (recherche et quantification de molécules pré
choisies), soit des bioessais (recherche d’activités et détermination du pourcentage
d’élimination) et éventuellement une approche couplant analyse chimique et bioessais
(mesure d’activités, identification de substances, comparaison des activités mesurées par
bioessais et des activités théoriques calculées à partir de l’analyse chimique).
Cette approche a été utilisée pour les composés estrogénomimétiques. L’activité estrogénique
observée dans les STEP est ainsi expliquée jusqu’à 90% par l’analyse d’hormones et
alkylphénols [Korner et al., 2000; Cargouet et al., 2004; Gomez et al., 2007]. Pour l’activité
AhR, cette approche n’a jamais été appliquée aux STEP mais elle a été utilisée afin
d’expliquer l’activité AhR présente dans les sédiments. L’analyse des HAP et PCB permet
généralement d’expliquer une partie de l’activité AhR, mais les corrélations sont plus faibles
que pour ER et généralement inférieures à 40% [Eljarrat et al., 2003; Houtman et al., 2006;
Louiz et al., 2008]. L’application récente de l’approche bioessais-analyse chimique pour
l’activité PXR a abouti à des résultats peu concluants. La corrélation entre l’activité PXR
mesurée dans des sédiments ou boues de STEP et la présence de ligands de PXR mesurée par
l’analyse chimique n’a atteint qu’au plus 1,5% [Patureau et al., 2008 ; Kinani et al., 2009 ;
Creusot et al., in press]. Les molécules environnementales responsables de l’activité PXR
restent donc à identifier.
135
Chapitre IV
Dans ce contexte, nous avons utilisé des outils de bioanalyse afin de caractériser la nature des
substances responsables des activités observées dans diverses matrices d’eaux usées. Nous
avons mesuré les activités ER et AhR dans les eaux et matières en suspension et les activités
ER, AhR et PXR dans les boues. Ce travail a donné lieu à un article qui sera prochainement
soumis pour publication.
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Dans ce travail, nous avons voulu caractériser l’activité estrogénique présente dans les
différents compartiments. L’équipe avait préalablement mis au point une technique utilisant
du récepteur ER recombinant afin de déterminer si l’activité estrogénique d’un échantillon est
due à des molécules de forte ou faible affinité. Dans ce travail, une technique similaire a été
mise au point. Cette technique est basée sur la capture de l’E2 et l’E1 dans les échantillons, par
des anticorps spécifiques. Elle permet de déterminer l’origine de l’activité estrogénique
mesurée. L’application de ces techniques a permis de montrer que :
Ö L’activité estrogénique présente dans les eaux et matières en suspension est mediée par
des ligands de ER de forte affinité. Inversement, des ligands de faible affinité sont
responsables de l’activité mesurée dans les boues.
Ö Ces ligands de forte affinité sont, entre autres, l’E2 dans les eaux et l’E1 dans les matières
en suspension.
Nous nous sommes ensuite intéressés aux boues qui présentaient des activités ER, AhR et
PXR. Comme pour le travail réalisé sur le sédiment de rivière (Chapitre III, Article 3), nous
avons appliqué un échantillon de boues sur du récepteur recombinant ER et PXR et étudié les
activités ER, AhR et PXR des fractions retenues et non retenues par la colonne sépharoserécepteur. Les résultats ont indiqué que :
Ö 34 à 40 % des activités ER et PXR sont dues à des ligands communs aux deux récepteurs.
Ö 42% de l’activité AhR est due à des ligands communs avec ER et 68% à des ligands
communs avec PXR.
Ö L’activité PXR est due à 67% à des ligands de forte à moyenne affinité pour le récepteur
et 33% à des ligands de faible affinité.
136
Chapitre IV
Tout comme pour le sédiment de rivière, la présence d’activités AhR et PXR dans la fraction
retenue par le récepteur ER, ou la présence d’activités ER et AhR dans la fraction retenue par
la colonne sépharose-PXR, montrent qu’il existe des ligands communs à au moins deux
récepteurs. Les pourcentages de ligands communs sont différents de ceux obtenus avec le
sédiment de rivière (Chapitre III) ce qui indique que les molécules, ou leur concentration sont
différentes dans les deux échantillons.
Ce travail a permis de montrer l’intérêt de combiner des bioessais à des techniques de
bioanalyse. Cette méthode devrait par la suite être couplée a des analyses chimiques et
permettre l’identification de ligands des trois récepteurs.
137
138
Characterization of endocrine disrupting compounds in wastewater
treatment by biochemical and biological assays
Sonia Dagnino1,2, Virginie Bellet1, Marina Grimaldi1, Catherine Grenot3, Elisabeth Mappus3,
Vincent Cavaillès1, Helène Fenet2, Patrick Balaguer1.
1
IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, 34298 Montpellier, France; INSERM, U896,
34298 Montpellier, France; Université Montpellier 1, 34298 Montpellier, France; CRLC Val d’Aurelle Paul
Lamarque, 34298 Montpellier, France.
2
UMR 5569 Hydrosciences, Université Montpellier 1, Av. Charles Flahault, 34060 Montpellier, France.
3
Hospices Civils de Lyon, Fédération d'Endocrinologie, Groupement Hospitalier Est, Bron, F-69677, France;
Inserm, U863, IFR 62, Lyon, F-69003, France; Université de Lyon, Université Lyon 1, F-69003, France;
Laboratoire d'Hormonologie, Centre de Biologie Est, Groupement Hospitalier Est, Bron, F-69677, France.
Abstract
Wastewater treatment plants (WWTPs) are sources of endocrine disrupting compounds (EDCs). As
they are only partially eliminated, identification of these EDCs is required in order to assess and
possibly limit their environmental impact after releasing via effluents discharge or sludge landfill.
Reporter cell lines are useful and rapid tools to detect the presence of endocrine disrupting activities in
environmental samples. In this study, we used ERĮ, PXR and AhR reporter cell lines to monitor EDCs
activities water, suspended solids and sludge from an urban WWTP. Furthermore, a battery of
complementary bioanalytical tools, recombinant ERĮ and PXR, antibodies against estradiol and
estrone were adapted and applied to characterize these activities. We showed that ER and AhR
activities were present in water dissolved compartment while ER, AhR and PXR activities were
noticed in suspended solids and sludge. We were able to determine that estrogenic activity is carried
by high affinity compounds in dissolved phase and suspended solids and these high affinity ER
ligands are mainly estradiol in dissolved phase and estrone in suspended solids. On the contrary,
estrogenic activity is mainly carried by low affinity compounds in sludge. Finally using recombinant
ERĮ and PXR ligand separation, we demonstrated that sludges contained common ligands for ERĮ,
PXR and AhR
Keywords: Estrogenic, AhR, PXR, wastewater, sludge, affinity column.
139
1. Introduction
The presence of endocrine disrupting compounds (EDCs) in surface waters and sediment has
been primarily attributed to their incomplete removal in the wastewater treatment process
(Desbrow et al., 1998; Jobling et al., 2002). Sources of EDCs, converge to wastewater
treatment plant (WWTP) were they are partially eliminated. In the receiving environment, fish
populations of anthropogenically influenced areas are simultaneously exposed to these EDCs
and disruption of the reproductive development have been observed in various species
(Purdom et al., 1994; Routledge et al., 1998; Jobling et al., 2002). The compounds that have
been identified to be at least partially responsible for the observed disruption can act as
agonists of the estrogen receptor ERĮ (Desbrow et al., 1998). Estrogenic activities in
wastewater effluent have been monitored using ER bioassays such as YES (Yeast Estrogen
Screen, Holbrook et al., 2002; Servos et al., 2005; Liscio et al., 2009), MELN assay (Cargouet
et al., 2004; Gomez et al., 2007; Dagnino et al., 2009) or E-Screen assay (Korner et al., 2000;
Nelson et al., 2007; Tan et al., 2007). In some works, in vitro tests have been coupled with
chemical analysis to determine the compounds implicated in the observed activities in
wastewater samples. Chemical analysis of known estrogenic compounds (ie natural and
synthetic hormones, alkylphenols, bisphenol-A…) have enabled to explain up to 90% of the
observed activity in the dissolved phase with hormones as the main contributors (Korner et
al., 2000; Korner et al., 2001; Murk et al., 2002; Nelson et al., 2007).
Chemicals present in wastewater could interfere with other hormonal systems. Recently,
several studies have shown that nuclear receptor Pregnane X (PXR) is able to bind
environmental contaminants such as pesticides (Lemaire et al., 2006), natural and synthetic
estrogens, alkylphenols (Jacobs et al., 2005; Mnif et al., 2007; Xue et al., 2007),
polychlorinated biphenyls (PCB) (Tabb et al., 2004; Jacobs et al., 2005), brominated flame
retardants (Pacyniak et al., 2007; Fery et al., 2009). The great number of EDCs that activates
PXR designs it as a xenosensor for chemical perturbation. PXR bioassay have already been
applied successfully in the detection of activity in sludges (Patureau et al., 2008, Mnif et al.,
in press), wastewater (Creusot et al, in press, Mnif et al., in press) and in sediments (Kinani et
al., 2009), although detection by chemical analysis of PXR known ligands have reached to
explain no more than 1.5% of the observed activities. Endocrine disruption can be also
mediated by cytosolic receptor AhR (Aryl Hydrocarbon Receptor). AhR activity have been
detected with different bioassays in sediment samples (Kannan et al., 2000; Machala et al.,
2001; Louiz et al., 2008), in wastewater (Ma et al., 2005; Dagnino et al., 2009; Mnif et al., in
140
press) and in sludge (Patureau et al., 2008; Mnif et al., in press). Polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAH), PCB and dioxins are known AhR ligands and AhR bioassays have been
used to monitor contamination of environmental matrices by such compounds. When done,
combination of bioassays and chemical analysis have lead to significant correlations and the
targeted analysed compounds could explain the measurable biological activity (Kinani et al,
2009, Louiz et al., 2008).
The complexity of wastewater matrices (water, suspended solids and sludge) presents a
challenge for achieving accurate determination of EDCs present in these wastes by single
chemical analysis. Therefore, for such complex mixtures, the integrative character of
bioassays can be a significant advantage. Indeed, they combine the effects of all contaminants
including additive, synergistic and antagonistic effects. They provide useful information on
the bioavailable fraction of the contaminants and they also integrate the effects of all
contaminants, including those, not considered or detected by chemical analysis. Although
bioassays are useful to detect EDCs activities, they give only little information on the nature
of the compounds that could mediate the observed activities and on their affinity for the
receptor. Pillon et al. (2005) developed a receptor binding technique that allows
discrimination between high and low affinity ER ligands mediating estrogenic activity in
environmental samples. This tool have permitted to determine that in water samples
estrogenic activity was mediated by high affinity compounds whereas low affinity compounds
mediated estrogenic activity in sediment. Specific antibodies developed against hormones
could allow the characterisation of these high affinity compounds. These antibodies usually
used within ELISA tests (Huang and Sedlak, 2001) allow the detection of hormones in
wastewater samples. The use of such antibodies in combination with bioassays could be an
interesting tool for detection of active compounds mediating observed activity.
Moreover, several studies have shown that environmental samples could mediate, not only
one, but several receptor activation, for instance ER, PXR and AhR activities observed in the
same sediment sample (Kinani et al., 2009), or ER, AhR, activities in wastewater samples
(Dagnino et al., 2009; Mnif et al., in press). Pillon et al. (2005) have developed an estrogen
receptor affinity column that allowed purification of ER active ligands. Detection of activities
with ER and AhR bioassays after purification showed that the two activities simultaneously
detected in sediment samples were mediated by different ligands (Pillon et al., 2005). In
another work performed also on a sediment sample, detection of ER, PXR and AhR activity
141
after purification by immobilized ER and PXR receptor showed that common ligands of the
receptors can be detected (Dagnino et al. submitted).
The objective of this work was to assess the usefulness of various biological methodologies,
both individually and in combination, to characterize ER, AhR and PXR activities in the
matrices of a WWTP using activated sludge treatment. This could be a first step which could
guide future chemical analysis which is long and expensive. For this purpose, we selected
water, suspended solids and sewage sludge samples from an urban treatment plant. We
characterized ER, AhR and PXR activities by using different approaches, reporter cell lines,
recombinant receptor and polyclonal antibody competitive binding and ERĮ and PXR
purification column.
2. Materials and methods
2.2 Materials
All solvents, ethyl acetate, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), used during extraction
(either pesticide-grade or HPLC-grade) were obtained from Carlo Erba Reactifs (Val de
Reuil, France). Materials for cell culture were obtained from Invitrogen (CergyPontoise,France). Luciferin was purchased from Promega (Charbonnières-les-Bains, France).
17ȕ-estradiol (E2, CAS #50-28-2), estrone (E1, CAS #53-16-7) and ethynilestradiol (EE2,
CAS #77538-56-8) were purchased from Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France),
SR12813 (CAS #126411-39-0) from Tebu-bio (Le Perray en Yvelines, France) and 2,3,7,8Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD, dioxin, CAS #1746-01-6) from Promochem (Wesel,
Germany). All effectors were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 10mM and
successive dilutions were performed in culture medium.
2.3 Samples collection and preparation
2.3.1 Sampling
Water, suspended solids influent and effluent as well as treated sludge were sampled in a
sewage treatment plant (WWTP) in March 2008. WWTP has a capacity of 470 000
population equivalents. The treatment of wastewater consists in classic primary treatment and
activated sludge reactor (AS) followed by a biofilter (BF). Primary and secondary sludges are
treated in an anaerobic reactor and are then exported for landfill or incineration. A general
outline of WWTP wastewater and sludge treatment is illustrated in Figure 1. Conventional
wastewater parameters including Biological Oxygen Demand (BOD5) and Suspended Solids
142
(SS) were analysed according to standard methods (APHA-AWWA-WPCF, 2005).
Figure 1 Wastewater and sludge flow scheme of municipal WWTP ASB with sampling locations (Õ)
2.3.2 Extraction procedures
Wastewater (250 mL for influent and to 500 mL for effluent) was filtered with Whatman
GF/C (1.2µm) filter and stored at 4°C until extraction performed within 48h. Water was
extracted by LC-18 reversed-phase cartridge (1g, 6 mL) provided by Alltech (Carquefou,
France) conditioned with 5 mL of methanol and 5 mL of HPLC-quality water using GX-271
ASPEC™ SPE extraction system. Sample was applied at a rate of 5 mL/min. After solidphase extraction, cartridges were rinsed with 5 mL of HPLC-quality water. Elution was
performed with 10 mL of ethyl acetate: methanol (5:1). Extracts were then filtered through
anhydrous sodium sulphate on a glass microfiber filter and rotary evaporated to dryness at
37°C. Residues were taken up with 1 mL of methanol for bioassay. The same procedure was
performed on a blank prepared with 500 mL distilled water; blanks tested on bioassay gave no
activity (results not shown).
Suspended solids fixed on GF/C (1.2 µm) filters and sludge were dried at 60°C for two days
before microwave extraction using a Multiwave 3000W (Anton Paar, France) equipped with
eight liners. Three dried filters supporting suspended solids samples or 1g dried sludge were
extracted at 120°C for 15 min at 1200W power, using 30 mL of acetone-hexane (1:1, v/v)
solvent mixture (Villar et al., 2004; Fountoulakis et al., 2005). After extraction, the
supernatant was collected and the residue was washed with hexane (3×5 mL). The extracts
were combined with supernatant and dried on anhydrous sodium sulphate before rotary
evaporation. The residue was taken up with 250 µL of DMSO for suspended solids and 1 mL
of methanol for sludge. Blank were performed using the same extraction procedure on clean
filters, analysis on bioassay showed no activity (results not shown).
143
2.4 MELN, HAhLP and HG5LNPXR bioassays
The stably transfected luciferase reporter cell lines were obtained as already described by
(Pillon et al., 2005; Lemaire et al., 2006). Briefly, MELN cell line was obtained by
transfecting ERĮ positive breast cancer MCF-7 cell line with the estrogen responsive element
cloned upstream of the luciferase reporter gene construct ERE-ȕGlob-Luc-SVNeo (Balaguer
et al., 1999). HAhLP cell line was obtained by transfecting HeLa cells with the XRE-tk-Luc
and pSG5-puro plasmids (Pillon et al., 2005). Generation of the PXR reporter cell lines was
done in two steps as already described by (Lemaire et al., 2006). The Gal4-responsive
reporter gene was first stably transfected into HeLa cells, generating HG5LN parent cell line
and, in a second step, these HG5LN cells were transfected with Gal4-PXR-puro plasmid
construct to obtain the HG5LN Gal4-PXR cell lines, respectively.
2.4.2 Cell culture conditions
HAhLP, HG5LNPXR, and MELN cell lines were grown in phenol red containing Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium F12 (DMEM), supplemented with 5% of foetal calf serum (FCS)
and 1% antibiotic (penicillin / streptomycin) in a 5% CO2 humidified atmosphere at 37°C.
Because of phenol red and FCS estrogenic activity, in vitro experiments were achieved in
DMEM F12 without phenol red, supplemented with 5 % dextran-coated charcoal-treated
foetal calf serum (DCC) and 1% antibiotic (penicillin / streptomycin).
Cells were seeded at a density of 25 000 cells/well for HAhLP, HG5LNPXR and 80 000
cells/well for MELN, in 96-well white opaque tissue culture plates (Greiner, France) in 180
ȝL test culture medium. Samples to be tested were prepared 4x ҏconcentrated in the same
medium. 50 ȝL were added per well 24 hr after seeding for HAhLP and HG5LNPXR and 72
hr for MELN cells. Compounds were incubated with cells for 8 or 24 hr for HAhLP cell lines
and 24h for MELN and HG5LNPXR. In all assays, each sample was tested at various
concentrations in quadruplicate, in at least three independent experiments which always
included both negative (solvent) and positive (E2, dioxin and SR12813) controls.
At the end of incubation, effector containing medium was removed and replaced by DMEM
F12 phenol red free media containing 0.3 mM luciferin. Luciferin diffuses into the cell and
produces a luminescent signal that is stable from 5 min on. Results are expressed as a
percentage of maximum luciferase activity. The maximum value, taken as 100, was obtained
144
in the presence of 10 nM E2 for MELN, 10 nM dioxin for HAhLP and 1µM SR12813 for
HG5LNPXR. The basal activity (in the absence of ligands) is 10% of the maximal activity for
HG5LNPXR, 15% for HAhLP and MELN.
2.4.4 Data analysis
Dose response curves of samples were modelled by using GraphPad Software (version 5.0
Inc., San Diego, CA, USA) in order to obtained whether the EC50 or EC25 of all samples.
Bioassay-derived E2, Dioxin or SR12813 Equivalents were determined by dividing the EC50
or EC25 of the reference (expressed in ng/L) by EC50 or EC25 of the sample (expressed in
ng/L of water or ng/g of suspended solids or sludges).
2.4.5 Toxicity tests
The parent HG5LN cell line was used to check the specificity and toxicity of the extracts. This
cell line contain the same reporter gene as the bioassay cells, this gene is integrated at the
same site in the genome. Moreover, its expression is not controlled by the receptor. In the
absence of tested compound, a basal luciferase signal is expressed by the cells, and
modification of the baseline activity by a tested compound or an environmental sample
reveals a non-specific activity or toxicity. All samples were tested on HG5LN cell line. For
some samples a slight toxicity was observed at 0.3% concentration in cell media. In that case,
samples concentration for the tests did not exceed 0.1%. For all other samples, no toxicity of
non-specific activation was observed.
2.5 ERĮ and PXR purification column
2.5.1 Recombinant nuclear receptor production
The recombinant histidine-tagged ERĮ triple mutant (Cys 381, 417, 53 => Ser) was produced
as already described by (Pillon et al., 2005; Riu et al., 2008). Briefly, transformed BL21 DE3
electrocompetent Escherichia coli were grown at 0.2 optical density (OD600nm) From this
point, temperature slowly reached 15°C (in 3 hr), and recombinant receptor synthesis was
induced with 0.6 mM isopropylthiogalactopyranoside under the same agitation for 16 hr.
Final OD600nm was about 1.4. The histidine-tagged LBD of human PXR (residues Glu140- Ser
434 in a pRSETA vector) (Chrencik et al., 2005) was expressed in Escherichia coli
BL21(DE3)plys. Cells were grown at 37°C in LB medium supplemented with 0.1 mg/mL
ampicillin and 0.034 mg/mL chloramphénicol until OD600nm reached about 0.1. Cells were
then incubated for 24 h at 22°C, final OD600nm was about 3.
145
Cell cultures were harvested by centrifugation at 8,000g for 20 min. The cell pellet from 8
liters culture was resuspended in 100 mL lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM
NaCl, 5 mM imidazole) supplemented with a protease inhibitor mixture (complete, mini,
EDTA-free tablet, Roche Applied Science). The suspension was then lysed by sonication and
centrifuged at 35,000 ´g and 4°C for 45 min. The supernatant was stored at -70°C until use.
Receptor concentration was evaluated by SDS-PAGE.
2.5.2 Purification of samples by immobilized recombinant receptor
All experimental steps were realised at 4°C, 20 nmol of recombinant ERĮ or PXR were
immobilized on 500 µL Ni-NTA-agarose phase (purchased from Quiagen). 40 µL of sludge
methanol extract were diluted in 500 µL of washing buffer (WB: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5,
300 mM NaCl, 20% glycerol, 0.1 mg/mL BSA, and 10 mM imidazole) and dropped on column
previously charged with the receptor. Three 500 µL washings with WB were collected and
liganded receptor was then eluted with 4 x 500 µL of eluting buffer (EB: 20 mM Tris-HCl, pH
7.5, 300 mM NaCl, 20% glycerol, 0.1 mg/mL BSA, and 200 mM imidazole). All fractions were
then warmed at 65°C for 5 minutes in order to precipitate all proteins and centrifuged at
10,000 rpm for 10 min. Activity in all collected fractions was determined with cell
luminescent assay. Recoveries of the activity of sample or ligands were determined for
washing (non-retained fraction) and elutions (retained fraction). All columns were carried out
at least in triplicate and all column fractions were detected by SDS-PAGE to follow receptor
elution. The specificity of the binding of all samples to the immobilized nuclear receptor was
controlled by using column without immobilized PXR of ERĮ. All selected compounds did
not bind to Ni-NTA phase when receptor was lacking and no activity was retained without
receptor (data not shown).
2.6 Inhibition test of MELN activation
MELN cells were seeded in 96-well white opaque tissue culture plates as described above. In
separate tubes, 0.1% or 0.3 % methanol extract of environmental sample was prepared 4xconcentrated and pre-incubated with the same volume with 4x-concentrated purified
recombinant ER-Į (1 to 100 nM final concentration) in test culture medium at 4°C for 16 hr.
Medium from MELN cell culture plates was then removed and replaced by 100 µL of test
culture medium supplemented with the same volume of pre-incubation medium. After 6 hr
incubation at 37°C, luciferase activity was determined.
146
2.7 Characterisation of estrogenic activity using polyclonal antibodies
MELN cells were seeded in 96-well white opaque tissue culture plates as described above. E1
and E2 at 3 nM and 0.1 nM respectively were incubated overnight at 4°C with antibody 1 and
2 at 1/50. Water, Suspended solids and sludge at 0.1% were incubated separately overnight
with the three antibodies. All samples without incubation with antibodies were used as control
of total estrogenic activities. 50 µL of each samples were added per well 72 hr after seeding
and incubated with cells for 6 hr. Each sample was tested in duplicate, in at least three
independent experiments which always included both negative (solvent) and positive (E2, EE2
and E1) controls. At the end of incubation, medium was removed and replaced by DMEM F12
phenol red free media containing 0.3 mM luciferin. 3. Results and discussion
3.1 Wastewater characterization
Wastewater dissolved phase present ER and AhR activities while no PXR activity was
detected. After treatment, ER and AhR activities were still detected in the treated wastewater
but at lower level. Estrogenic activity varied from 58.7 ng/L E2 Eq. in influent to 1.2 ng/L E2
Eq. in effluent (Table 1). WWTP with activated sludge is known to present removal
efficiency of estrogenic activity higher than 80% as observed in the present study (97%).
Dioxin-like activity measured in water varied from 55.3 ng/L TCDD Eq. in influent to 13.6
ng/L TCDD Eq. in effluent (Table 1). It is know that wastewater vehicles AhR ligands such as
some HAP and PCB (Pham and Proulx, 1997; Blanchard et al., 2004). Although only few
works measured dioxin-like activity in wastewater, our results are similar or slightly higher
than other studies (Macova et al., ; Reungoat et al., ; Dagnino et al., 2009). Activated sludge
process was able to remove 75.4% of dioxin-like activity as previously observed (Dagnino et
al., 2009). PXR activity was only detected in suspended solids effluent at 4.1 ng/L of
SR12813 Eq. (Table 1).
147
Table 1. ERĮ, AhR and PXR receptor activity determined in wastewater, suspended solids and sludge
samples (n.a. : no activity detected)
E2 Eq.
TCDD Eq.
SR12813 Eq.
ng/L of water
ng/L of water
µg/L of water
Influent
58.7 (± 0.9)
55.3 (± 1.8)
na
Effluent
1.5 (± 0.2)
13.6 (± 2.3)
na
Influent
3.3 (± 0.3)
37.5 (± 3.7)
na
Effluent
1.2 (± 0.1)
3.1 (± 0.8)
4.1 (± 1)
E2 Eq.
TCDD Eq.
SR12813 Eq.
ng/g of dried SS
µg/g of dried SS
µg/g of dried SS
Influent
13 (± 1.2)
147 (± 14.5)
na
Effluent
78 (± 6.6)
184 (± 53)
268 (± 60)
E2 Eq.
TCDD Eq.
SR12813 Eq.
ng/g of dried sludge
µg/g of dried sludge
µg/g of dried sludge
6.7 (± 0.3)
0.8 (± 0.2)
39.8 (± 3)
Water
SS
SS
Sludge
Treated
Compounds responsible for estrogenic activity in wastewater treatment have been largely
described in literature and activity is usually attributed to hormones and alkylphenols (Ternes
et al., 1999b; Korner et al., 2000; Fenet et al., 2003; Servos et al., 2005). These two families
of compounds differ in their affinity for ER. Hormones are high affinity ER ligands. Their
EC50 values in MELN cell lines range from 17.6 pM to 694 pM (Pillon et al., 2005).
Conversely, alkylphenols have lower affinity for the receptor, their EC50 values ranging from
54.2 nM to 17.6 µM (Pillon et al., 2005).
Pillon et al. (2005) designed a simple transactivation assay in which compounds of high
affinities were captured by limited amounts of recombinant ERĮ and whose capture led to
selective inhibition of transactivation. This procedure was applied to our samples. In both
water and suspended solids samples, inhibition of activity was almost complete (Figure 2A
and B) showing the presence of high affinity compound. Other studies obtained similar results
(Mnif et al., in press). As previously mentioned, high affinity estrogenic compounds present
in wastewater are usually identified as hormones.
148
Figure 2 Inhibition test of MELN activation with recombinant ERĮ capture of (A) water (B)
suspended solids and (C) sludge extracts.
In order to determine if the high affinity compounds were estradiol (E2), estrone (E1), or
ethynilestradiol (EE2), we used polyclonal antibodies directed against these hormones. The
capacity of the two antibodies to inhibit estrogenic activity of E1, E2 and EE2 which are
known high affinity estrogens in environmental urban samples were tested (Figure 3A).
Estrogenic activity of E1 and E2 decreased in presence of Ac1 whereas only estrogenic
activity of E2 was decreased with Ac2. EE2 activity was never decreased by use of Ac1 and
Ac2.
The estrogenic activity in the four wastewater samples containing high affinity estrogens
(Figure 3B) was characterized by these two antibodies. Estrogenic activity of water extracts
was partially decreased in presence of Ac1 and Ac2 which suggest the presence of E2. On the
contrary, estrogenic activity of suspended matter extracts was partially but preferentially
decreased in presence of Ac1 which indicates that E1 is more present than E2 in this sample.
Note that EE2 or another high affinity compound could mediate part of the activity in water
and in suspended matter effluent since Ac1 and Ac2 were not able to inhibit completely the
estrogenic activity.
A number of authors have reported on fate of natural hormones into WWTP. Estrogenic
activity in water phase is a least partially attributed to presence of E2. Baronti et al. (2000)
showed that in activated sludge treatment removed E2 at 85% which is in agreement with the
removal rates of estrogenic activity that we measured in dissolved phase. Suspended solids
estrogenic activity seems to be due principally to presence of E1. Numerous works, showed
that the efficiency for E1 removal in activated sludge is lower than for other hormones, (2580% as reviewed by (Khanal et al., 2006)). Moreover, in 4 out of 30 WWTP studied by
(Baronti et al., 2000) E1 concentration increased from influent to effluent. We found that
149
suspended solids carried E1. Theses findings agree with the measure of estrogenic activity in
suspended solids that increases from influent to effluent. Increase of E1 from influent to
effluent in suspended solids could result from degradation of E2 in dissolved phase during
activated sludge treatment that was partially transformed into E1 or to a conjugated form of E1
that is cleaved into parent compound during treatment and adsorbed onto suspended solids
(Ternes et al., 1999a).
Figure 3 Inhibition of estrogenic activity induced by estrone (E1), 17b estradiol (E2) and
ethynilestradiol (EE2) in MELN cell lines using 3 different polyclonal antibodies (AC1, AC2 and
AC3) (A). Inhibition of estrogenic activity in water, suspended solids and sludge samples using AC1,
AC2 and AC3 antibodies (B).
3.2 Sludge characterization
Sludges are complex matrices and the presence of endocrine disruptors activities have been
poorly documented due to evident analytical challenges and strong toxicity.
Estrogenic activity in sludge was of 6.7 ng/g E2 Eq (Table 1). Few studies have detected
estrogenic activity in treated sludge. Our values were stronger than the one detected by
(Patureau et al., 2008), much lower than the one detected by (Holbrook et al., 2002) (20-58
ng/g E2 Eq.) and (Hernandez-Raquet et al., 2007) (higher than 200 ng/g E2 Eq.) and in the
150
same ranges than the results of (Korner et al., 2000) and (Mnif et al., in press)(2-19 ng/g E2
Eq.). Variations of estrogenic activity in sludge in the literature indicate the complexity of
measuring biological activities in sludge matrices.
In the present study, values of estrogenic activity in sludge were similar to the one measured
in the suspended solids influents. This could indicate that estrogenic activity in sludge could
be due to suspended solids sedimentation. The characterization of estrogenic activity with
inhibition test could determine if the ligands responsible of the observed activities present the
same affinity for the receptor than those found in suspended solid. The addition of a limited
amount of recombinant ERĮ in transactivation of MELN cell lines was not followed by a
decrease of the activity (Figure 2C). Compounds with low affinity were not captured by
recombinant receptor and therefore no inhibition of activity was observed. Thus, in sludge,
the estrogenic compounds seem to be mainly compounds of low affinity for the receptor ER
and therefore different from the one in suspended solids. Theses results were in agreement
with (Mnif et al., in press) who also concluded that sludge carries low affinity estrogenic
compounds. As active compounds are mainly low affinity in sludges, it is not valuable to
follow the investigation with antibodies.
In sludge we also detected AhR and PXR activities. AhR activity was present at 0.8 µg/g
TCDD Eq which is similar to the little number of value found in the literature (Patureau et al.,
2008) and (Mnif et al., in press) in sludge samples. PXR activity was of 40 µg/g SR12813 Eq.
As for AhR, the values concerning PXR activity are few in the literature. The observed
activity is higher than the one detected by (Patureau et al., 2008) and (Mnif et al., in press).
Although, (Kinani et al., 2009) showed that PXR activity was strong in river sediment
contaminated by anthropogenic activity, and measured values similar than in our sample. The
presence of ERĮ, AhR and PXR activities in sludge raises concern over possible presence of
common ligands for the three receptors.
In previous work, we developed ER and PXR affinity column (Pillon et al., 2005, Dagnino et
al. submitted) which allow the purification of active compounds on the receptor. In order to
characterize these activities, the sludge sample extract was loaded on one hand on ERĮ
affinity column and on the other hand on hPXR-affinity column and PXR, ERĮ and AhR
activities of retained and not retained fractions from ERĮ and PXR column were measured.
These activities are expressed in percentage of total recovered activity (Figure 4 and 5).
We measured a sample loss of 47 %( ± 15%) of the total ER activity during ERĮ purification
and 68% (± 10.2%) of the total PXR activity during PXR column purification. When loading
sample on receptor-free column we obtained similar loss percentage, which means that loss of
151
activity was not due to a lack of receptor-ligands separation during precipitation of the
receptor. In previous work, we purified radiolabeled compounds with receptor column and
measured no loss which means that the loss of activity may not be due to non specific binding
of compounds to phase or column support (Riu et al., 2008). We can assume that loss could
be explained by dilution of the activity which can not be detected under certain limits and is
therefore counted as a loss.
Purification of sample on ER-column showed that 90% (±14%) of recovered estrogenic
activity was retained on ERĮ column. In previous works performed on wastewater effluent
(Pillon et al, 2005) or on river sediment (Dagnino et al, submitted), we have shown that the
ERĮ column retained most of the ERĮ environmental ligands whatever the affinity for ER.
34% of PXR activity was retained by ERĮ column which means that 34% of PXR activity is
mediated by common ERĮ-PXR ligands which was similar to previous work performed on
river sediment (30% common ER-PXR activity) (Dagnino et al. in press). Recent work has
demonstrated that ER and PXR receptor could be activated by common ligands (Mnif et al.,
2007). With inhibition test with ERĮ receptor we showed that estrogenic compounds in the
present sludge sample were of low affinity for the receptor (Figure 2C). Common ER-PXR
activity is probably due to low affinity ER ligands. Some alkylphenols, 4tert-octylphenol and
nonylphenol mixture are low affinity ER ligands and PXR activators (Pillon et al., 2005; Mnif
et al., 2007). Other compounds may share the same characteristics, UV screen 4methylbenzylidene camphor (Gomez et al., 2005; Pillon et al., 2005; Mnif et al., 2007), or bis
(2-Ethylhexyl) phthalate (Harris et al., 1997; Mnif et al., 2007).
Figure 4 Measurement of the recovered ER, PXR and AhR activity following purification of the
treated sludge sample on ERa affinity column. Results are represented in % of recovered activity. Not
retained: pooled washing fractions and flow through; retained pooled elution fractions.
152
In the same way, 42% of AhR activity was retained on ERĮ column, which means that 42%
of AhR activity is mediated by common ERĮ and AhR ligands. This result is different from
previous works in sediment sample (Pillon et al., 2005, Dagnino et al. submitted), where
common AhR and ERĮ ligands represent only 17% of the AhR activity. As few common ERĮ
and AhR environmental compounds have been reported in the literature, it is difficult to
explain this common activity. AhR ligands such as TCDD and 3-methylcholanthrene (3MC)
are able to partially activate ERs due to the formation of a ternary complex (ER-Į, AhR, and
ARNT) (Ohtake et al. 2003). AhR ligands in sludge sample could activate MELN cells
through this mechanism although activation through this mechanism is only partial and cannot
explain all the observed activities. Other studies have reported that PCBs 29 and several
benzothiazoles could activate both AhR and ER receptor in recombinant yeast assay
(Noguerol et al., 2006). It was also demonstrated that the AhR ligand 3-MC and/or its
metabolites are ER activators (Liu et al, 2006; Swedenborg et al, 2008). These compounds
have also low affinity for ER (EC50 5.5-8 mg/L) and could therefore be responsible for the
common ER-AhR activities.
Purification of sample on PXR-column showed that 67% (± 2.5%) of recovered PXR activity
was present in the PXR column retained fraction. We showed in a previous work (Dagnino et
al., submitted) that the PXR affinity column do not allow to capture low and extremely low
affinity PXR ligands. Our result indicates that 67% of total PXR activity in sludge is mediated
by compounds with high to medium affinity for PXR (EC50 > 1µM). Known environmental
contaminants with PXR medium affinity are rare. Some drugs, such as hyperforine, pesticides
as pretilachlore, phytohormones, such as zearalanol have been described as medium affinity
compounds (Jacobs et al., 2005; Lemaire et al., 2006; Mnif et al., 2007).
40% (± 10%) of estrogenic activity was retained by the PXR-affinity column. This means that
at least 40% of estrogenic activity is mediated by common ER-PXR ligands which are in
agreement with the results obtained with ER column. Moreover, those ligands are medium to
high affinity (EC50 < 1 µM) for PXR. As previously mentioned, recent work have reported
common ER-PXR ligands, such as hormones, alkylphenols which could be responsible of the
common ER-PXR activity (Mnif et al., 2007). In this sample, common ER-PXR ligands are
medium affinity for ER, and PXR. Such compounds could be 4tert-octylphenol (EC50 for ER
54.2 nM and EC50 for PXR 2.7 µM), or most likely unknown compounds.
153
Figure 5 Measurement of the recovered PXR, ER and AhR activity following purification of the
treated sludge on hPXR affinity column. Results are represented in % of recovered activity. Not
retained: pooled washing fractions and flow through; retained pooled elution fractions.
68 % of AhR activity was retained by the hPXR-affinity column indicating that more than
half of PXR ligands are common PXR-AhR agonists. In previous work (Dagnino et al.
submitted) we found that in sediment sample 57% of AhR activity was retained by PXR
column which is similar to current result. Few, common PXR-AhR ligands have been
reported in the literature. PCB 118 activates PXR (Creusot et al. in press) and is a partial
agonist for AhR (Hestermann et al., 2000). A number of brominated biphenyl ethers (BBE)
that are AhR inducers (Hamers et al., 2006) have also been recently demonstrated to activate
PXR (Fery et al., 2009).
Published data indicate that some environmental contaminants could bind the three receptors.
BBE are ER, AhR and PXR activators and could at least partly mediated common activities.
These compounds have been measured in sewage sludge at concentrations varying from 12 to
3000 ng/g (Langford et al., 2005; Knoth et al., 2007). Interestingly, batch tests showed that
BBE are hydrophobic compounds (logKow >8) with high sorption potential and that their
removal in wastewater treatment is mediated via association with solids will be the major
mechanism. Other unknown compounds may also contribute to the activities. The ER and
AhR activators benzothiazoles (Noguerol et al., 2006), were never been measured for their
effects on PXR although, they are able to induce CYP3A4 which is a PXR target gene (Seo et
al., 2000). Benzothiazoles have been detected in wastewater treatment and described as
persistent compounds to degradation (Kloepfer et al., 2004; Kloepfer et al., 2005; De Wever
et al., 2007).
154
Supplementary studies are necessary to ascertain if these molecules mediate part of the
observed AhR, ER and PXR activities and/or to identify others common ligands among
environmental compounds.
Conclusion
Bioassays and bioanalytical techniques allow the characterisation of ERĮ, AhR and PXR
activities in water, suspended solids and sludge. Recombinant ER inhibition tests showed that
estrogenic activity in water and suspended solid was mediated by different types of
compounds, high affinity in water and suspended solids and low affinity in sludge. With
antibodies we showed that part of high affinity compounds are estradiol and estrone in water
and suspended solids while low affinity compounds in sludges still remain to be identified.
Affinity receptor-column demonstrated that sludge sample contained a mixture of medium
and low affinity ligands for PXR, and that part of those ligands were also ER and AhR
ligands. F. The combination of bioassay and bioanalytical techniques permits to give an
orientation and guide further chemical analysis for the detection of endocrine disrupting
compounds responsible for toxic effects.
155
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Conclusions et Perspectives
Le suivi de perturbateurs endocriniens au cours du traitement des eaux usées a été
fréquemment étudié. De nombreuses études relatent des abattements des activités
estrogéniques dans des stations d’épuration fonctionnant avec des boues activées. Cependant,
des lacunes subsistaient dans la littérature. Les informations disponibles concernaient
majoritairement des traitements classiques comme les boues activées. Dans la littérature, peu
d’informations concernaient des systèmes de traitements non conventionnels comme le
lagunage et les lits bactériens. Les études ne prenaient en compte que la phase dissoute des
eaux usées et seules de rares études incluaient la phase particulaire et les boues dans le suivi.
De plus, si l’activité estrogénique a été largement étudiée, les données sur des activités
médiées par d’autres récepteurs comme le récepteur AhR, n’étaient que très parcellaires alors
que les eaux usées véhiculent des contaminants capables de se lier à des récepteurs de type
AhR mais aussi PXR. Certaines substances sont des ligands communs à plusieurs récepteurs.
Une étude plus globale des activités observées dans les différents compartiments des stations
d’épuration nous paraissait intéressante pour une caractérisation plus complète de la
contamination, préalable à une analyse des molécules susceptibles d’être responsables des
activités observées.
C’est pourquoi au cours de ce travail de thèse, différents aspects du devenir des PE dans les
systèmes de traitement des eaux usées ainsi que différentes méthodes de caractérisation des
ligands ont été abordés :
Ö Suivi des PE activateurs de ER et AhR au cours du traitement par lagunage et lit
bactérien en comparaison avec les boues activées
Ö Etude de la contribution des matières en suspension dans les activités retrouvées dans
les stations de traitement
Ö Développement d’outils bioanalytiques pour la caractérisation des activités ER, AhR
et PXR observées, et leur application sur des matrices environnementales et aux
différents compartiments des eaux usées (eaux, matières en suspension et boues).
L’étude du devenir des activités estrogéniques et dioxine-like dans les stations de traitement
des eaux usées a permis de déterminer l’efficacité de traitements peu conventionnels comme
le lagunage et le lit bactérien par rapport à un traitement classique par boues activées. La
165
détection à l’aide de deux tests in vitro (MELN et HAhLP) nous a permis de mettre en
évidence que les systèmes lagunaires présentent des rendements épuratoires similaires ou
supérieurs aux traitements par boues activées et supérieurs aux traitements par lits bactériens
pour l’élimination de substances estrogéniques. Cette efficacité est probablement liée au
temps de rétention hydraulique plus importants dans les lagunes que dans les autres
traitements. Pour les substances dioxine-like, le traitement par lit bactérien présente des
rendements épuratoires supérieurs au lagunage et aux boues activées. Cette étude a également
permis de déterminer que la combinaison de traitements différents améliore l’élimination de
substances estrogéniques, comme l’ajout de lagunes de finition après lit bactérien ou l’ajout
de précipitation par chlorure ferrique en amont des boues activées.
Dans une deuxième étude, nous avons déterminé l’implication des matières en suspension
dans le devenir de PE estrogéniques et dioxine-like au cours du traitement des eaux usées.
Nous avons sélectionné trois systèmes de traitement ayant des capacités d’élimination de
matières en suspension différentes. Nous avons montré que les matières en suspension
contribuent à l’activité globale mesurée en entrée et sortie de stations de traitements des eaux
usées et que la contribution en sortie était essentiellement liée à l’efficacité des systèmes de
traitement à éliminer les matières en suspension. Ces résultats ont mis en évidence
l’importance de l’élimination des matières en suspension au cours du traitement puisque
l’activité qu’elles portent n’est que très faiblement voire pas dégradée.
Des études récentes ont mis en évidence la présence de ligands du récepteur PXR dans des
échantillons environnementaux comme les boues de stations de traitements par boues activées
et des sédiments de rivières. Afin de mieux caractériser les ligands de PXR présents dans les
milieux environnementaux, nous avons mis au point une méthode de purification de ces
ligands basée sur du récepteur recombinant fixé sur sépharose comme cela avait été fait pour
le récepteur ER. Cette technique a été validée à l’aide d’un échantillon de sédiment de rivière
contenant des ligands des récepteurs ER, AhR et PXR. La purification de cet échantillon sur
colonne PXR a révélé que l’activité PXR était relayée par un mélange de ligands ayant des
affinités différentes pour le récepteur. L’utilisation de colonnes d’affinités ER et PXR
combinées aux lignées cellulaires nous a permis de déterminer qu’une partie des activités
observées dans l’échantillon était relayée par des ligands communs aux récepteurs ER-AhR,
ER-PXR et PXR-AhR.
166
Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié l’apport de différents outils de
bioanalyse dans la caractérisation des ligands des récepteurs ER, AhR et PXR dans les
différents compartiments d’une station d’épuration par boues activées (eau, matières en
suspension et boues). La caractérisation de l’activité estrogénique avec la capture par
récepteur en solution a permis de déterminer que l’activité estrogénique était due à des ligands
de forte affinité pour le récepteur dans l’eau et les matières en suspension et de faible affinité
dans les boues. Les anticorps dirigés contre E1 et E2 ont montré que l’activité était relayée
majoritairement par de l’E2 dans l’eau et par du E1 dans les matières en suspension.
L’échantillon de boues activait les trois récepteurs ER, AhR et PXR. La purification de cet
échantillon sur colonnes ER et PXR a conduit à la caractérisation de la part de ligands
communs aux 3 récepteurs et également d’émettre quelques hypothèses sur la nature des
ligands responsables d’une partie des activités, afin de guider une future identification
chimique.
Les travaux menés au cours de cette thèse ont illustré l’intérêt de l’utilisation de méthodes
bioanalytiques permettant d’intégrer les effets de tous les PE présents dans une matrice
environnementale indépendamment de la structure chimique des molécules recherchées.
L’avantage des tests in vitro est leur capacité à estimer les effets perturbateurs endocriniens
cumulés d’un mélange de substances chimiques. Les bioessais permettent de mesurer une
activité globale, mediée par des molécules connues et inconnues. De plus, l’analyse de divers
échantillons de compartiments différents (eau, matières en suspension, boues, sédiments)
permet d’avoir une idée de la répartition des substances recherchées dans les compartiments
environnementaux.
De plus, des outils de bioanalyse, comme ceux développés au cours de ce travail, permettent
de caractériser les échantillons les plus actifs et les plus complexes, induisant, par exemple,
des effets sur plusieurs récepteurs. Ces outils sont complémentaires aux tests in vitro et
servent de lien entre les bioessais et la détection par analyse chimique. En effet, les bioessais
ne permettent pas d’identifier les molécules responsables des activités observées.
L’identification de ces substances est une étape essentielle car elle permet la mesure et la
quantification de la contamination. Diverses techniques d’analyse chimique ont été
développées comme la chromatographie en phase gazeuse (CPG) ou la chromatographie en
phase liquide (CLHP) couplées à des systèmes de détection sensibles, en général la
spectrométrie de masse (SM). La SM est sensible, sélective et permet de fournir des
informations structurales sur les produits détectés, ce qui est indispensable pour la détection
167
de nouveaux PE. Depuis quelques années les méthodes analytiques multi résidus se sont
développées. Ces méthodes s’adaptent bien à la problématique de PE puisqu’elles permettent
le dosage de plus de 100 substances en une seule injection chromatographique. Parmi ces
nouvelles méthodes, dans l’ordre croissant de sélectivité et de pouvoir de résolution, on
trouve le spectromètre de masse quadripolaire, le spectromètre de masse à Temps de Vol
(TOF : Time Of Flight) et le spectromètre de masse haute résolution à secteur magnétique. De
plus, l’hybridation des techniques, notamment pour la technique q-TOF, permet d’obtenir des
hautes performances analytiques, pour l’investigation de matrices complexes comme les eaux
usées et les boues. Toutefois la mise en œuvre de ces technologies demeure à ce jour
financièrement inabordable pour chaque échantillon suspecté.
Pour cela, l’association des méthodes biologiques et analytiques est indispensable à une
appréhension rigoureuse du problème de la contamination environnementale par les
perturbateurs endocriniens. L’approche TIE « Toxicity Identification Evaluation » utilise la
combinaison de méthodes analytiques et biologiques. Cette méthode a été développée pour
étudier la toxicité des effluents urbains. La technique repose sur le schéma général suivant :
extraction de l’échantillon et fractionnement en fonction de la polarité, les fractions sont
ensuite testées par bioessai et seulement les fractions les plus actives sont analysées.
L’activité dosée par bioessai est ensuite comparée à l’activité estimée à partir de composés
identifiés.
Dans ce travail, nous avons mis au point diverses techniques qui pourraient être intégrées
dans ce type d’approche. On pourrait envisager d’introduire la purification d’échantillon sur
colonne ER, ce qui permettrait d’avoir une fraction contenant uniquement les composés
estrogéniques à analyser. Cette méthode a déjà été appliquée avec succès pour l’identification
de composés estrogéniques dans des « petits pots » destinés à l’alimentation du nourrisson et
a permis d’identifier les composés responsables de l’activité mesurée [Riu et al., 2008].
L’utilisation de la colonne PXR permettrait la séparation de ligands de forte à faible affinité
pour le récepteur. L’approche TIE pour l’activité PXR a pour le moment échoué et l’apport de
cette technique de purification pourrait améliorer l’identification.
De plus, d’autres outils peuvent être intégrés à cette approche. L’utilisation de tests de capture
par des anticorps spécifiques permet de confirmer le lien direct entre l’activité mesurée et la
substance identifiée. C'est-à-dire, si on observe une baisse d’activité après capture de la
molécule identifiée, cette molécule devrait être responsable de l’activité. Ces nouvelles
approches sont des perspectives intéressantes pour la détection de PE non identifiés dans
l’environnement et notamment dans des matrices complexes comme les eaux usées.
168
La recherche et la mesure de PE dans les STEP est indispensable pour limiter la
contamination du milieu récepteur. Les eaux usées rejetées par les stations d’épuration sont
source de PE dans l’eau. Comme une partie des travaux de cette thèse l’illustre, les systèmes
de traitement des eaux usées ont des performances variables. Les effluents sont généralement
encore chargés en substances actives présentes à des concentrations suffisantes pour induire
des effets sur la faune aquatique. Les risques sont d’autant plus élevés si les eaux usées sont
réutilisées, pour l’irrigation agricole, la recharge de nappes ou pour la fabrication d’eau
potable. La réutilisation des eaux usées traitées a lieu essentiellement dans les zones arides ou
semi-arides, mais avec la raréfaction de la ressource en eau elle pourrait s’étendre aux zones
tempérées. Pour atteindre une qualité de l’eau permettant de minimiser l’impact des rejets et
de consentir la réutilisation, des traitements plus poussés doivent être appliqués. Comme nous
l’avons vu, les traitements biologiques comme les boues activées et le lit bactérien permettent
une réduction de la quantité de PE dans l’eau mais certains PE sont toujours présents en fin de
traitement.
Actuellement d’autres traitements sont envisagés pour améliorer l’efficacité du traitement.
Les bioréacteurs à membranes se sont largement développés ces dernières années comme
système de traitement pour les eaux usées. Ces systèmes sont prisés pour leur facilité
d’entretien et l’espace restreint qu’ils requièrent. Les quelques études qui se sont penchées sur
le devenir de PE dans ce type de traitement ont cependant montré des efficacités similaires à
celles obtenues par des systèmes de traitement par boues activées. Une solution intéressante
serait d’ajouter un traitement tertiaire poussé aux traitements classiques déjà existants.
Comme nous l’avons montré au cours de ce travail, des traitements tertiaires (lagunes de
finition ou biofiltre) peuvent augmenter les performances de traitement d’une STEP pour les
PE. De nouveaux traitements peuvent être appliqués aux eaux usées en finition. Le charbon
activé est un traitement fréquemment utilisé pour le traitement de l’eau potable lorsque la
source d’eau est de qualité médiocre. Ce traitement est connu pour sa capacité d’élimination
des contaminants organiques. Des études pilotes et en taille réelle montrent des résultats
prometteurs pour l’élimination de PE par ce type de traitement. Actuellement les traitements
de désinfection sont investigués pour l’élimination de PE, comme l’ozonation et la chloration.
L’ozonation a montré des bons résultats pour l’élimination de PE, notamment pour
l’élimination d’hormones stéroïdiennes. Cependant, le traitement à l’ozone créant des sousproduits formé par oxydation, son efficacité est donc limitée. Avec la désinfection au chlore,
169
des résultats similaires ont été observés avec production de sous-produits pouvant être aussi
dangereux que les substances mères.
Des traitements plus efficaces qui n’engendrent aucun sous-produit sont la nanofiltration ou
l’osmose inverse. L’osmose inverse est utilisée actuellement dans des stations de réutilisation
des eaux usées et semble efficace pour l’élimination de PE. L’inconvénient de ce type de
méthode est toutefois un coût élevé.
Pour que ce type de traitement soit appliqué dans le système des eaux usées la réglementation
doit être renforcée. Actuellement aucune limite de rejet de substances PE n’est fixée pour le
traitement des eaux usées. Pour l’eau potable, des limites sont fixées pour certaines
substances, comme certains pesticides, qui sont périodiquement analysées. Ces tests devraient
également être pratiqués sur les eaux usées afin d’améliorer la qualité des rejets. Il faut aussi
également prendre en compte les critères de coût d’entretien et d’installation qui peuvent être
importants pour ce type de traitements poussés.
Aujourd’hui il apparait important de renforcer la connaissance sur le devenir de PE au cours
des nouveaux traitements développés. Les études à venir devraient inclure le suivi aussi bien
de la phase dissoute que de la phase particulaire des eaux usées qui contribue également à
l’apport de PE. De plus, l’utilisation de bioessais et d’outils bioanalytiques en combinaison
avec l’analyse chimique doit être poursuivie et améliorée. Ces outils doivent être utilisés afin
d’arriver à une identification des substances mises en causes pour les effets néfastes observés
dans la faune aquatique et suspectés chez l’homme.
Cette identification permettra de tenir à jour et d’améliorer la réglementation sur les rejets des
eaux usées. Au vu de la raréfaction des ressources en eau douce, la qualité de l’eau doit être
préservée et les traitements des eaux usées doivent être améliorés afin de permettre une
réutilisation.
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210
Annexe
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Biological analysis of endocrine disrupting compounds in
Tunisian sewage treatment plants.
Wissem Mnifa,b, Sonia Dagninob,c, Aurélie Escandeb,c, Arnaud Pillonb, Hélène Fenetc, Elena
Gomezc, Claude Casellasc, Marie-Josèphe Duchesneb, Guillermina Hernandez-Raquetd,
Vincent Cavaillèsb, Patrick Balaguerb, + and Aghleb Bartegia.
a
Laboratoire de Biochimie, Unité de Recherche 02/UR/09-01, Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir 5000,
Tunisie.
b
IRCM, Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, 34298 Montpellier, France ;
INSERM, U896, 34298 Montpellier, France ; Université Montpellier 1, 34298 Montpellier,
France ; CRLC Val d’Aurelle Paul Lamarque, 34298 Montpellier, France.
c
UMR 5569 Hydrosciences Montpellier, Université Montpellier 1, 15 Avenue Charles Flahault, B.P. 14491-34093
Montpellier, France.
d
INRA UR050, Laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement, 11100, Narbonne, France.
+ Corresponding author: Dr. Patrick BALAGUER.
E-mail: patrick.balaguer@valdorel.fnclcc.fr
211
Annexe
Abstract
Endocrine disrupting compounds (EDCs) are frequently found in wastewater treatment plants
(WWTPs). So far, research has been mainly focused on the detection of estrogenic compounds and
very little work has been carried out on other receptors activators. In this study, we used reporter cell
lines, which allow detecting the activity of estrogen (ERĮ), androgen (AR), pregnane X (PXR),
glucocorticoid (GR), progesterone (PR), mineralocorticoid (MR) and aryl hydrocarbon (AhR)
receptors, to characterise the endocrine disrupting profile of the aqueous, suspended particulate matter
and sludge fractions from three Tunisian WWTPs. The aqueous fraction exhibited estrogenic and
androgenic activities. Suspended particulate matter and sludge extracts showed estrogenic, aryl
hydrocarbon and pregnane X receptor activities. No GR, MR or PR (ant) agonistic activity was
detected in the samples suggesting that environmental compounds present in sewage may have a
limited spectrum of activity. By performing competition experiments with recombinant ERĮ, we
demonstrated that the estrogenic activity detected in the aqueous fraction was due to EDCs with strong
affinity for ERĮ. Conversely, in the sludge fraction, it was linked to the presence of EDCs with weak
affinity. Moreover, by using different incubation times, we determined that the EDCs present in
suspended particulate matter and sludge, which can activate AhR, were more readily degraded than
chlorinated compounds, suggesting that they were mostly polycyclic aromatic hydrocarbons.
Key words: estrogenic, dioxin-like, PXR, wastewater, bioassay, nuclear receptor.
Abbreviations used
AR,
androgen
receptor;
AhR,
aryl
hydrocarbon
receptor;
BaP,
Benzo(a)pyrene;
BBP,
butylbenzylphtalate; BFR brominated flame retardants; BOD biological oxygen demand; BPA,
bisphenol-A; DBD, DNA-binding domain; COD chemical oxygen demand; DBP, di-n-butylphtalate;
DCC, dextran-coated charcoal; p,p’-DDE, 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene; DDT,
dichlorodiphenyl trichloroethane; DEHP, diethylhexylphtalate; DMEM, dulbecco's modification of
eagle's medium; DMSO, dimethyl sulfoxide; E1, estrone; E2, 17β-estradiol; E2 EQ, estradiol
equivalent; E3, estriol; EC50, concentration that activates 50%; EDCs, endocrine disrupting
compounds; EE2, ethynylestradiol; ER, estrogen receptor; ERE, estrogen-responsive element; EROD,
Etoxyresorufine-O-Deetylase; FCS, foetal calf serum; GAL4, yeast transcription factor GAL4; GR
glucocorticoid receptor; LBD, ligand binding domain ; Luc, firefly luciferase; 3MC, 3methylcholanthrene; MR mineralocorticoid receptor, NP, nonylphenol; NPm, nonylphenol mixture,
PAHs, polycyclic aromatic hydrocarbons; PCB, polychlorinated biphenyls; PR progesterone receptor;
PXR, pregnane X receptor;; SPE, solid phase extraction; WWTPs, wastewater treatment plants; HRT,
hydraulic retention time.
212
Annexe
1. Introduction
In the last two decades, the development of human, industrial and agricultural activities have
generated an increasing amount of organic pollutants such as natural and synthetic hormones,
alkyl phenols, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs),
brominated flame retardants (BFRs), organochlorine pesticides and many more. Most of these
chemicals have toxic, carcinogenic and/or mutagenic properties that can disrupt the normal
functioning of the endocrine system (Kavlock et al., 1996). Hence, they are recognised as
endocrine disrupting compounds (EDCs) and they have been associated with degenerative
effects such as feminisation, reduction of fertility, changes in sex ratio, developmental
degeneration in fish populations (Purdom et al., 1994; Routledge et al., 1998; Jobling et al.,
2002) as well as breast cancer cell proliferation in humans (Soto et al., 1995). Most of these
chemicals may therefore have a deleterious impact on the aquatic fauna and more generally
on wildlife and human health.
The main sources of EDCs are domestic, industrial and agricultural wastes which end up in
WWTPs where they should be eliminated. However, the efficacy of sewage treatment in
WWTPs is measured using parameters, such as BOD (Biological Oxygen Demand) and COD
(Chemical Oxygen Demand), which do not take into account EDC removal. In fact, during
sewage treatment, EDCs are only partially eliminated and estrogenic compounds are
frequently detected in WWTP effluents (Ternes et al., 1999b; Svenson et al., 2003; Johnson
et al., 2005; Gomez et al., 2007; Tan et al., 2007). As WWTP effluents are discharged in the
environment, the presence of endocrine disruptors has been reported in the receiving waters,
rivers, sediments (Fenet et al., 2003) and in the marine environment (Noppe et al., 2007).
The study of the presence of EDCs in environmental samples classically involves chemical
analyses which detect all kinds of pollutants. However, in the case of complex mixtures, such
as sewage and WWTP effluents, this approach is limited as only known substances can be
analysed and its costs strongly limit the number of substances that can be assessed.
Furthermore, the biological effects of chemical mixtures, such as additivity, synergy or
antagonism, cannot be predicted from individual analytical chemical results.
In vitro bioassays appear to be more suitable for the evaluation of chemical mixtures extracted
from environmental samples. In vitro bioassays, based on EDC mechanisms of action, may be
very useful to rapidly and inexpensively determine the total biological potency of distinct
substances or chemical mixtures. These tests are based on the capacity of genetically modified
cells to express the luciferase enzyme following the activation of nuclear receptors by natural
213
Annexe
or xenobiotic ligands. Such bioluminescent cell lines have been widely used to evaluate
dioxin or estrogenic activities in food or complex environmental mixtures (Pillon et al., 2005;
Gomez et al., 2007; Riu et al., 2008). Cell bioassays can assess the overall endocrine
disrupting potential of a sample and suggest a potential mechanism of action (agonistic,
antagonistic) for the complex mixtures of pollutants found in wastewater. Indeed, EDCs
found in WWTPs have many ways of action, one of them is binding to nuclear receptors, such
as ERs (estrogenic receptors), GR (glucocorticoid receptor), MR (mineralocorticoid receptor),
PR (progesterone receptor), AR (androgen receptor) and PXR (pregnane X receptor), or to
receptors present in the cytoplasm, like the AhR (aryl hydrocarbon - dioxin receptor).
We developed luciferase reporter cell lines that can be used to perform large screens to detect
the activity of modulators of nuclear and dioxin receptors in WWTP samples (Balaguer et al.,
1999; Terouanne et al., 2000; Balaguer et al., 2001). The occurrence of these EDCs in sewage
treatment plants has been well documented by several studies around the world (Desbrow et
al., 1998; Ternes et al., 1999a; Svenson et al., 2003; Bila et al., 2007; Kim et al., 2007;
Stasinakis et al., 2008; Dagnino et al., 2009). However, there are only few figures for the
Mediterranean area (Gomez et al., 2007; Stasinakis et al., 2008) and no data at all concerning
Tunisian WWTPs. Therefore, in this study we decided to characterise the endocrine
disrupting potential of Tunisian WWTP samples using the luciferase reporter cell lines we
developed. Moreover, despite the existence of several studies investigating the presence of
EDCs in wastewater, most of them were focused exclusively on WWTP aqueous fractions.
Suspended particulate matter is often not included in wastewater analysis and concentrations
of EDCs in sludge are rarely determined. On the other hand, due to the relatively high
octanol-water partition coefficients of these compounds, it is reasonable to expect that a
significant part of EDCs is adsorbed to the suspended particulate matter or accumulated in
biosolids. Therefore, we collected aqueous, suspended particulate matter and sludge samples
from three Tunisian WWTPs to characterise the endocrine disrupting potential of these three
fractions.
214
Annexe
2. Materials and methods
2.1 Materials
Cell culture products were obtained from Life Technologies (Cergy-Pontoise, France).
Luciferin was purchased from Promega (Saint-Quentin-Fallavier, France). Aldosterone, BaP,
dexamethasone, E2 and 3-methylcholanthrene (3MC) were purchased from Sigma Chemical
Co (St. Louis, MO, USA). R5020 (promegestone) was a gift from Sanofi-Aventis
(Romainville, France). R1881 (methyltrienolone) and SR12813 were purchased from NEN
Life Science Products (Paris, France) and Tebu-bio (LePerray en Yvelines, France),
respectively. Dioxin was obtained from Promochem (Molsheim, France). For bioassays
experiments, stock solutions were prepared in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 10 mM and
stored at –20°C.
2.2 Generation of stably transfected reporter cell lines
The stably transfected luciferase reporter cell lines were obtained as already described
(Balaguer et al., 2001). Briefly, the MELN cell line, to measure ER transcriptional activation,
was obtained by transfecting MCF-7 cells (ERĮ−positive breast cancer cells) with the EREβGlob-Luc-SVNeo construct in which an estrogen responsive element (ERE) was cloned
upstream of the luciferase reporter gene (Balaguer et al., 1999).
PALM cells, to characterise AR transcriptional activation, are human prostate
adenocarcinoma PC-3 cells stably transfected with human AR and an AR-responsive element
cloned upstream of a luciferase reporter gene construct (Terouanne et al., 2000).
HAhLP cells, used to detect dioxin receptor-mediated activity, were obtained by transfecting
HeLa cells with the CYP1A1-Luc and pSG5-puro plasmids (Pillon et al., 2005).
HG5LNGal4-PR, - GR, - MR and -PXR cells, used to detect progesterone-, glucocorticoid-,
mineralocorticoid- or PXR-like activities, were derived from HeLa cells in two steps. HG5LN
cells were obtained by stably transfecting a Gal4-responsive reporter gene into HeLa cells.
The resulting cells were then stably transfected with the Gal4 DNA Binding Domain (DBD) hPR Ligand Binding Domain (LBD),
-hGR (LBD),
-hMR (LBD) and -hPXR (LBD)
expressing plasmids, respectively (Lemaire et al., 2006; Molina-Molina et al., 2006).
2.3 Cell culture conditions
HG5LN and MELN cell lines were grown in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
with phenol red, 1 g/l glucose, 5% of foetal calf serum (FCS) (culture medium) and 1 mg/ml
geneticin in a 5% CO2 humidified atmosphere at 37°C. HG5LN GalGR, -MR, -PR and -PXR
cells were cultured in culture medium supplemented with 1 mg/ml geneticin and 0.5 μg/ml
215
Annexe
puromycin. The HahLP cell line was cultured in culture medium supplemented with 0.5
μg/ml puromycin. Because of phenol red and FCS steroid activity, in vitro experiments were
carried out in DMEM without phenol red and supplemented with 5% dextran-coated,
charcoal-treated FCS (DCC) (test culture medium). PALM cells were maintained in Ham’s
F-12 medium supplemented with 10% FCS, 1 mg/ml geneticin and 1 μg/ml puromycin in a
5% CO2 humidified atmosphere at 37°C. The test culture medium was Ham’s F-12 medium
supplemented with 3% DCC.
2.4 Sample collection
Wastewater, suspended particulate matter and sludge were sampled in three WWTPs with
similar treatment capacities (Sites A, B and C) located along the Tunisian coastal area (Fig.
1).
Fig. 1- Location of the three WWTPs (Site A, B and C) along the Tunisian coastal area.
The main characteristics of each WWTP are described in Table 1. Site A influents were from
domestic and industrial origins (i.e., plastic, detergent, painting and other chemical waste).
Site B treated only domestic sewage waste from an area with intense tourist activity. Finally,
Site C received both domestic and industrial (mainly textile industry) influents. The three
WWTPs performed a primary (sedimentation), secondary (activated sludge) and tertiary
(chlorination) treatment before discharging the effluents into the Mediterranean Sea. Site B
used anaerobic sludge, whereas Sites A and C aerobic conditions.
216
Annexe
Table 1- Characteristics of three WWTPs
Population
Flow
Equivalents
3
(m /d)
BOD5
influent
(mg/L)
Suspended
solids
influent
HRT (h)
(mg/L)
Site A
300 000
24 000
500
400
24
Site B
132 000
17 430
400
380
12
Site C
323 000
18 700
420
450
8
BOD5, Biological Oxygen Demand; HRT, hydraulic retention time.
2.5 Sample preparation
Samples from Sites A, B and C were collected between November 2003 and March 2004. In a
first group of experiments, a few millilitres of influent and effluent wastewaters from Sites A
and B were collected. They were filtered through a solvent-rinsed Whatman GF/C filter
(Whatman) to eliminate the suspended solids and were then stored at -20°C. When needed,
they were thawed and filtered through a 0.22 µm nitrocellulose filter (Corning). Different
amounts (up to 50 μl) of filtered samples were directly added to the culture medium.
In a second group of experiments, wastewater samples (1.5 L) were collected from Site A, B
and C influents. Raw water samples were centrifuged (2000g, 15 min) to eliminate the
suspended solids. Supernatants were then extracted by solid phase extraction as already
described in (Pillon et al., 2005). Briefly, aqueous samples were concentrated on reverse
phase C-18 (5g, 20 mL) cartridges (Sigma Aldrich, France) preconditioned with methanol.
Elutions from columns were performed with methanol followed by hexane. Eluates were
dried at 37°C in a rotary evaporator and residues were taken up in 2 ml methanol
(concentration factor 750).
From the same sites, larger influent wastewater samples (5 L from Site A, 9 L from Site B and
6 L from Site C) and sludge were also collected. Suspended particulate matter was recovered
by centrifugation of these samples. Suspended particulate matter and sludge were
homogenised before lyophilisation. Lyophilised samples (2.7 g, 5.7 g and 0.84 g of suspended
particulate matter from Sites A, B and C, respectively, and 20 g of sludge for each site) were
then extracted twice with dicholoromethane/methanol (2:1 v/v) (for 20 and 30 min). Extracts
were dried by passing through anhydrous sodium sulphate on glass microfibers and after
evaporation in a rotary evaporator they were taken up with 2 ml methanol. Concentrations
217
Annexe
factors for suspended matters were 2500, 4500 and 3000 for sites A, B and C respectively.
Methanol extracts were stored at -20°C. Filtered aqueous samples and concentrated samples
from the aqueous, suspended particulate matter and sludge fractions were then added to stably
transfected reporter cell lines and receptor activation was measured by luciferase assay.
2.6 Luciferase assay
For luciferase assay, 5x104 cells per well were seeded in 96-well white opaque tissue culture
plates (Greiner, France) with 150 µl test culture medium/well. Eight hours after plating, 50 μl
of filtered aqueous samples or concentrated extracts diluted in test culture medium were
added to each well for 16h except in HAhLP cells, in which WWTP samples were left for 8h
or 24h. Experiments were performed in quadruplicate. At the end of the incubation time, the
test culture medium was removed and replaced by fresh test culture medium containing 0.3
mM luciferin. Intact living cell luminescence was measured with a Microbeta Wallac
luminometer (E & G) for 2s and expressed as relative luminescence units (RLU). Sample
activities were expressed as the percentage of the maximal activity obtained with the
reference ligand at saturating concentration: i.e., 10 nM for E2 and R1881; 100 nM for
dexamethasone, aldosterone and R5020; 1 μM for SR12813, and 10 nM for dioxin, in MELN,
PALM, HG5LN Gal-GR, -MR, -PR, -PXR and HahLP cells, respectively.
In parallel, tests were performed to ascertain that the agonistic activities were specific. For
MELN, PALM and HAhLP cells, the activation of luciferase expression was measured in the
presence of the saturating concentration of the specific agonist and increasing concentrations
of sample extracts. If no super-activation was observed with the sample, the sample activity
was considered specific. For HG5LN derivatives cells, the HG5LN parent cell line was used
because it contains the same reporter gene as the derivative cells. In addition, the reporter
gene is integrated at the same site in the genome and its expression is constitutive. HG5LN
cells show a basal activity in the absence of any tested compound. Any modification of this
baseline activity by a sample indicates that this activity is non-specific. On the other hand, the
activity of a sample, which induces luciferase expression in the derivative cells but not in the
parental HG5LN cells, is considered specific. Tests were also performed to detect antagonistic
activities of samples. To this aim, cells were activated with the reference agonist at a
concentration yielding 80% of the maximal activity in the presence of increasing
concentrations of sample extracts.
218
Annexe
2.7 Inhibition test of MELN activation
To assess whether high affinity estrogens were present, even at low concentration, we used a
method described earlier and called “Inhibition test of MELN cell activation” (Pillon et al.,
2005). In this test, transactivation of cellular ERĮ by high affinity estrogenic compounds is
competitively inhibited by limited amounts of recombinant ERĮ. MELN cells were seeded in
96-well white opaque tissue culture plates as described above. In separate tubes, WWTP
filtered aqueous samples and methanol extracts were diluted in test culture medium at the
concentration needed to obtain 80% of MELN cell maximal activity and pre-incubated
without or with concentrated purified recombinant ERĮҏҞ 1, 10 and 100 nM final concentration)
in test culture medium at 4°C for 16 hr. Then culture medium of MELN cells was removed
and cells were incubated with the different pre-incubated mixtures for 6h at 37°C before
luciferase assay.
2.8 Statistics and EC50 values
Each agonist concentration response curve was fitted using the sigmoidal dose-response
function of a graphic and Graph-Pad Prism, version 4.0, 2003 (Graphpad Incorporated, San
Diego. CA). EC50 (the concentration yielding half of the maximum activity) values were
calculated from the same dose-response curves.
2.9 Expression of WWTP samples’ activities
WWTP samples’ activities were determined by dividing the EC50 of the reference chemicals
(expressed in ng/L for E2 and μg/g for dioxin and SR12813) by that of the sample (expressed
as equivalent per litre of water or per gram of dry suspended particulate matter or sludge). The
calculation takes into account the fold-concentration of the methanol extracts over the crude
samples. Three reference EC50 values were taken from published results: 0.018 nM (4,9 ng/L)
for E2 in MELN cells (Pillon et al., 2005), 140 nM (70,63 μg/L) for SR12813 in HG5LN
Gal4-PXR cells (Lemaire et al., 2004) and 0.1 nM (28.4 ng/L) for R1881 in PALM cells
(Molina Molina et al, 2006). The reference EC50 value for dioxin in HAhLP cells (0.2 nM or
64.4 ng/L) was derived from the present experiments in which cells were incubated for 8h
(see Results).
219
Annexe
3. Results
3.1 Estrogenic activity of WWTP filtered aqueous samples
In the first phase of this study, estrogenic activity was assessed in influent and effluent,
filtered aqueous samples from Site A and B by measuring luciferase activation in MELN
cells. Filtered influent samples from both sites showed more than or around 70% of the
maximum estrogenic activity when present at 10% concentration in test culture medium
(Figure 2). The effluent sample from Site A was nearly as active as the corresponding
influent, whereas the effluent from Site B exhibited only very little activity. Taking into
account the EC50 of the reference ligand E2 (4.79 ng/L), we evaluated the concentration of
estrogenic compounds in the water samples. Concentration ranged between 79 and 119 ng/L
E2 eq for the influents and corresponded to 58.5 ng/L E2 eq for the effluent from Site A,
whereas it was below the quantification limit for Site B (Table 2). For Site B, the limit of
quantification (around 47 ng/L E2 eq for this experiment) was used to calculate the removal
percentage. Therefore WWTP removal efficiency of estrogenic compounds was only 26% for
Site A and above 88% for Site B.
Table 2- Estrogenic activity of influents and effluents of Sites A and B.
Site A
Site B
Concentration (pmol E2 eq/l)
Influents
291 ± 18.5
400 ± 56.3
Effluents
215 ± 18.8
nd
Removal efficiency
26.1 %
nd
Results were determined from the dose-response curves shown in Figure 2 and expressed as a ratio of E2 (reference agonist)
equivalent per litre of water. nd: not determined values because the activity of Site B effluents was to low to allow EC50
calculation.
220
Annexe
Fig. 2- Estrogenic activity of influent and effluent filtered aqueous samples from Site A and B measured using MELN cells.
Non-concentrated influent () and effluent (z) samples from Site A and influent () and effluent ({) samples from Site B.
The percentage of luciferase activity measured per well (mean ± SD of quadruplicates) is represented as a function of the
percentage of aqueous sample in the test culture medium. . The value obtained in the presence of 10 nM E2 was taken as 100
% transactivation.
3.2 Estrogenic activity of WWTP concentrated aqueous, suspended particulate
matter and sludge methanol extracts
In the second phase of the study, we analysed the influent aqueous, suspended particulate
matter and sludge methanol extracts from the three WWTPs (dose response curves in Fig. 3A,
B and C). Taking into account the concentration factor, the estrogenic activity of influent
samples ranged between 54.5 and 81.7 ng/L E2 eq for the aqueous, 8 and 24.5 ng/g E2 for the
suspended particulate matter and between 5.4 and 19 ng/g E2 eq for the sludge extracts (Fig
4A). When taking into account the weight of particulate matter per litre (0.54, 0.63 and 0.14
g) for Site A, B and C, respectively, the activity was estimated to be 8.4, 5.7 and 3.5 ng/L E2
eq for Sites A, B and C, respectively, which represents less than 15% of the corresponding
value for aqueous samples.
The specificity of the measurements was confirmed by performing experiments in which cells
were incubated with 10 nM of saturating E2 and increasing concentration of WWTP extracts.
There was no or negligible super-activation with 0.03% and 0.01% extracts (100-120%, not
shown) except for the sludge extract from Site C (145%, not shown). In conclusion, the
estrogenic activity of WWTP influents from Site A, B and C was mainly present in aqueous
samples rather than in suspended particulate matter or sludge.
221
Annexe
Fig. 3- Estrogenic activity of aqueous, suspended
Fig. 4- Endocrine disrupting activities in aqueous,
particulate matter and sludge extracts from the three
suspended particulate matter and sludge extracts from
Tunisian WWTPs measured in MELN cells. Aqueous
Site A, Site B and Site C. The reference ligands were A)
(A), suspended particulate matter (B) and sludge extracts
E2 in MELN cells, B) dioxin in HAhLP cells and C)
(C) from Site A (), Site B () and Site C (Ì).ҏ The
SR12813 in HGPXR cells. The activities were expressed
percentage of luciferase activity per well (mean ± SD of
as reference ligand equivalent per liter in aqueous
quadruplicates) is represented as a function of the
extracts (light gray bars), and as ligand equivalent per g
percentage of WWTP extract in the test culture medium.
in suspended particulate matter (medium gray bars) and
The value obtained in the presence of 10 nM E2 was
sludge (dark gray bars) extracts. They represent the ratio
taken as 100% transactivation.
between the EC50 values given by the dose-response
curves of WWTP samples and the EC50 values of the
reference compounds ± SD and they take into account the
fold-concentration of the methanol solution over the
WWTP crude sample.
222
Annexe
3.3 High affinity estrogens are present in concentrated aqueous samples
To determine whether the estrogenic activity detected in WWTP samples was due to low or
high affinity compounds, we performed the “inhibition test of MELN cell activation”, in
which ERĮ transactivation by high affinity estrogenic compounds is competitively inhibited
by limited amounts of recombinant ERĮ (0 to 100 nM) ҏ(Pillon et al., 2005). We observed that,
in the presence of 100 nM recombinant ERĮ, the luciferase activity induced by the aqueous
samples from the three sites was close to background level (20%, as shown in Fig. 2 and 3),
indicating that it was strongly inhibited by recombinant ERĮ (Fig. 5 for Site A and data not
shown). This result shows that the aqueous samples contained high affinity compounds, such
as natural and synthetic hormones; by contrast, suspended particulate matter and sludge
extracts contained lower affinity estrogens like alkylphenols.
Fig. 5- Inhibition test of MELN cell activation. Luciferase activity induced by aqueous ( ), suspended particulate matter ( )
and sludge extracts (Ìҗҏ from Site A was measured in the presence of 0-100 nM recombinant ERĮҠ The percentage of
luciferase activity measured per well (mean ± SD of quadruplicates) is represented as a function of the percentage of WWTP
extract in the test culture medium. The value obtained in the presence of 10 nM E2 was taken as 100% activity.
3.4 PR, GR and MR activities were not detected in WWTP samples
HG5LN-Gal4 PR, -Gal4 GR and -Gal4 MR cell lines were used to measure the respective
(ant)agonistic activities in Site A, B and C aqueous, suspended particulate matter and sludge
extracts. No agonistic activity was detected (not shown). As a number of endocrine disruptors
have PR, GR and MR antagonistic activities (Willemsen et al., 2004; Molina-Molina et al.,
2006), the same cell lines were used to assess the antagonistic activities in the same extracts.
Again, no activity was detected (data not shown).
223
Annexe
3.5 Weak AR agonistic activity are detected in WWTP samples
PALM cells were used to measure androgenic agonistic and antagonistic activities in aqueous,
suspended particulate matter and sludge extracts from Sites A, B and C. Cells were either
incubated with the different extracts in the absence of R1881 to assess agonistic activities, or
in presence of R1881 to assess antagonistic activity. Weak agonistic activity was only
observed in aqueous extracts (Fig. 6). Taking into account the concentration factor, the
activity ranged between 37.9 and 75.7 ng/L. This androgenic activity was specific since preincubation with 100 nM R1881 and 0.03 and 0.1% aqueous extracts did not increase
luciferase activation (data not shown). No antagonistic activity was detected (not shown).
Fig. 6- Androgenic activity in aqueous extracts from the three Tunisian WWTPs measured with PALM cells. The percentage
of luciferase activity of aqueous extracts from Site A (), Site B () and Site C (Ì) per well (mean ± SD of quadruplicates)
is represented as a function of the percentage of WWTP extract in the test culture medium. The value obtained in the
presence of 100 nM R1881 was taken as 100% transactivation.
3.6 AhR activity in WWTP samples
HAhLP cells were used to detect AhR agonistic activity in WWTP samples. No AhR
agonistic activity was detected in filtered influent samples (not shown). At all sites, AhR
activity was stronger in suspended particulate matter and sludge extracts than in concentrated
aqueous samples (Fig. 7), where it was too low to allow quantification (Fig.7A). AhR activity
in suspended particulate matter extracts, as measured after 8h incubation time (Fig.7B), was
41.29 µg/g dioxin eq at Site A, 0.64 µg/g dioxin eq at Site B and 3.22 µg/g at Site C (Fig.
4B). In sludge extracts, AhR activity corresponded to 0.64 µg/g dioxin eq at Site B, 1.28/g at
224
Annexe
Site B and 32.2 ng/g at Site C. When specificity was assessed, we observed that all responses
were specific except those due to Site C sludge extracts at concentrations higher than 0.03%
(not shown). In conclusion, AhR activity was mainly observed at Site C (domestic origin and
textile industry).
Fig. 7- Xenobiotic activity of aqueous, suspended particulate matter and sludge extracts from the three Tunisian
WWTPs measured with HahLP cells. Aqueous (A), suspended particulate matter (B) and sludge (C) extracts
from Site A (), Site B () and Site C (Ì).ҏThe percentage of luciferase activity per well (mean ± SD of
quadruplicates) is represented as a function of the percentage of WWTP extract in the test culture medium. The
value obtained in the presence of 100 nM dioxin was taken as 100 % transactivation.
3.7 Evaluation of AhR activity induced by 3MC, BaP, dioxin and WWTP samples in
HAhLP cells after two different incubation times
In order to better characterise AhR activity, HAhLP cells were exposed to the different
samples for 8h and 24h. Previous works (Jones et al., 2000; Machala et al., 2001), where the
CYP1A1 gene reporter cell line was used to study the mechanisms of AhR-mediated
induction, reported that, due to degradation, luciferase activation by PAHs decreased after 6h
of incubation, whereas it did not change when induced by dioxin-like compounds.
225
Annexe
HAhLP cells were incubated with 3MC, Benzo(a)pyrene (BaP), dioxin, aqueous, suspended
particulate matter or sludge extracts for 8h and 24h. 3MC and BaP induction of luciferase was
stronger after 8h incubation than after 24h, and their EC50 values were higher after 24h than
after 8h (3MC: 37 nM at 24 h versus 13 nM at 8h; BaP: 130 nM versus 35 nM) (Fig. 8). In the
case of dioxin, activation was lower after 24h, but the EC50 did not change much (0.56 nM at
8h versus 0.8 nM at 24h) (Fig. 8). Finally, luciferase induction by WWTP extracts from site A
was stronger after 8h than after 24h incubation and EC50 values were much higher after 24h
than after 8h like for 3MC and BaP (Fig. 9). These results indicate that Site A contained
mainly metabolically labile agonistic compounds. The same findings were obtained also for
Site B and C (data not shown).
Fig. 9- Induction of luciferase activity by WWTP extracts
Fig. 8- Induction of luciferase activity by dioxin, 3MC
from Site A in HAhLP cells after two different incubation
and BaP in HAhLP cells after two different incubation
times. HAhLP cells were incubated with aqueous (z, {),
times. HahLP cells were incubated with dioxin (, ),
suspended particulate matter (
, Ì) or sludge (, )
, Ì) or BaP (z,{) for 8h (dark symbols) and
extracts for 8h (dark symbols) and 24h (open symbols).
24h (open symbols). The luciferase activity, expressed as
The luciferase activity, expressed as relative luciferase
relative luciferase units (RLU) per well (mean ± SD of
units (RLU) per well (mean ± SD of quadruplicates), is
quadruplicates), is represented as a function of the ligand
represented as a function of the percentage of WWTP
concentration.
extract in the test culture medium.
3MC (
226
Annexe
3.8 PXR activity in WWTP samples
HG5LN-Gal4 PXR cells were used to detect PXR activity in the different samples. Like for
AhR activity, we did not observe any PXR agonistic activity in influent filtered samples (not
shown) and aqueous extracts (Fig. 10A). Conversely, we detected a strong PXR activity in
suspended particulate matter and sludge extracts (Figs 10B and C). PXR activity reached 0.20.3 µg/g SR12813 eq in suspended particulate matter extracts from all sites, 0.22 µg/g
SR12813 eq in Site A sludge extracts and only around 0.05 µg/g SR12813 eq in Site B and C
sludge extracts (Fig. 4C). Moreover, we observed that all responses were specific except those
induced by incubation with sludge extracts from Site C (not shown) at concentrations higher
than 0.03%.
Fig. 10- Xenobiotic activity of aqueous, suspended particulate matter and sludge extracts from the three Tunisian WWTPs
measured with HGPXR cells. Aqueous (A), suspended particulate matter (B) and sludge (C) extracts from Site A (), Site B
() and Site C (Ì).ҏ The percentage of luciferase activity per well (mean ± SD of quadruplicates) is represented as a function
of the percentage of WWTP extract in the test culture medium. The value obtained in the presence of 1 μM SR12813 was
taken as 100 % transactivation.
227
Annexe
4. Discussion
In this work, we characterised the EDCs present in three Tunisian WWTPs (Site A, B and C)
by using several luciferase reporter cell lines we developed to detect the activity of
modulators of nuclear and dioxin receptors in WWTP samples (Balaguer et al., 1999;
Terouanne et al., 2000; Balaguer et al., 2001).
We first assessed the estrogenic disrupting potential of influent and effluent, filtered
wastewater samples from Site A and B using MELN cells. The results show that influents
from both sites had a significant estrogenic activity and that, at Site A, these compounds were
not totally eliminated upon wastewater treatment. On the other hand, the estrogenic activity
was found to be insignificant in site B effluent sample, indicating a very efficient
biodegradation upon treatment. As site A receives domestic and industrial sewage, whereas
site B collects exclusively domestic (locals and tourists) wastewater, the presence of more
recalcitrant chemicals from industrial sources may explain this difference. Our results are in
agreement with published studies showing that estrogenic activity is present in WWTP waters
(Desbrow et al., 1998; Harries et al., 1999; Körner et al., 1999; Svenson et al., 2003; Aerni et
al., 2004; Fernandez et al., 2007; Gomez et al., 2007; Tan et al., 2007; Fernandez et al., 2008).
Aqueous, suspended particulate matter and sludge extracts also presented estrogenic activity.
Using competition experiments (Pillon et al., 2005), strong affinity compounds were shown to
be present in aqueous extracts, whereas lower affinity compounds were mainly in suspended
particulate matter and sludge extracts. These differences could be due to the fact that highaffinity compounds (natural estrogens such as E2, E1 and
E3,
or synthetic estrogens like EE2)
coming from human rejections (Baronti et al., 2000; D'Ascenzo et al., 2003) are present
mainly in aqueous extracts, whereas weak-affinity chemicals like nonylphenols, which show
higher adsorption properties, (Fenet et al., 2003; Hernandez-Raquet et al., 2007) could be
adsorbed to sludge .
We then tested whether other EDCs were present in the different extracts and detected a weak
androgenic agonist activity. This activity however was only found in aqueous extracts. Other
studies also found weak androgenic activity in wastewater (Kirk et al., 2002; Leusch et al.,
2006; van der Linden et al., 2008). An earlier Canadian study characterised AR activity as
being mediated by testosterone compounds from animal feedings and human faeces (Lee et
al., 2004). No progesterone, glucocorticoid and mineralocorticoid (ant)agonistic activities
were observed. Similar findings about progesterone activity were reported by van der Linden
and co-workers (van der Linden et al., 2008), who, however, found 11 to 38 ng/L
228
Annexe
Dexamethasone eq in wastewater. Our results also disagree with those by Chang and coworkers (Chang et al., 2007), who detected six glucocorticoids (prednisone, prednisolone,
cortisone, cortisol, dexamethasone, and 6 alpha-methylprednisolone) in sewage treatment
plants. These discrepancies could be due to the extraction procedures we used which may not
be efficient enough for this type of compounds.
Concerning AhR activity, we observed dioxin-like activity mainly in suspended particulate
matter extracts, and determined that the dioxin-like activity was mostly due to metabolically
labile compounds such as PAHs. Theses results are in agreement with another study
concerning the Tunisian region which shows that AhR activity is mediated by the same kind
of compounds (Louiz et al., 2008). Since PAHs have high logKow coefficients, they tend to
accumulate in sludge and suspended solids as observed also in this work. Finally, PXR
activity could be measured only in suspended particulate matter and sludge extracts and the
values were similar to those obtained in sludge extracts in France (Patureau et al., 2008). PXR
activity could be due to some environmental compounds like estrogens, nonylphenols or
pesticides (Lemaire et al., 2006; Mnif et al., 2007). To precisely identify the compounds
responsible for the PXR activity in our samples, we are currently testing a recombinant PXRbased purification procedure (Dagnino et al. in preparation) similar to the ERĮ-based affinity
columnswe previously used for the isolation of estrogen compounds (Pillon et al., 2005; Riu
et al., 2008).
Conclusion
We studied the EDC activity of three Tunisian sewage treatment plants that receive
wastewater from different sources (domestic and industrial). Our results show a difference in
the efficiency of wastewater treatment between site A (26%) and B (stronger %) possibly due
to the nature (aerobic in site A; anaerobic in B) and duration of treatment at each site (shorter
at Site A than at Site B). In aqueous extracts, ER, AR, AhR and PXR activities were roughly
comparable. In suspended particulate matter extracts, the strongest estrogen and AhR
activities were detected at Site C, and PXR activity was more important at the two industrials
sites (A and C). Sludge extracts from sites A and C presented more toxicity at 0.1% methanol
concentration. Finally, PR, GR and MR agonist and/or antagonist activities were not detected
in the samples from the three sewage treatment plants.
229
Annexe
Acknowledgements
This study was co-funded by the Tunisian Ministry for the Scientific Research, the
Technology and the Development of Competences, to the Research Unit 02/UR/09-01 of the
Higher Institute of Biotechnology of Monastir and by the Embassy of France in Tunisia /
EGIDE Montpellier, France (SSHN, 2008). WM is currently at the Department of Biology of
the Higher Institute of Biotechnology of Sidi Thabet, University of Manouba, Tunisia.
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CARACTERISATION DE PERTURBATEURS ENDOCRINIENS AU

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