IDEIA Herpes Simplex Virus [DE]

Key Code TSMX7845
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
CA 1 855 805 8539
US 1 855 2360 190
ROW +31 20 794 7071
IDEIA Herpes Simplex
Virus
DE
K605711-2
96
Ein amplifizierter Enzymimmunoassay für die Bestimmung von
Herpes Simplex-Viren in humanen klinishcen Proben.
1.
ZWECKBESTIMMUNG
Der IDEIA™ Herpes-simplex-Virus (HSV)-Test ist ein qualitativer
amplifizierter Enzymimmunoassay zum direkten Nachweis von
Herpes-simplex-Viren (HSV) in humanen klinischen Proben von
symptomatischen Patienten.
2.
ZUSAMMENFASSUNG
HSV ist ein behülltes DNA haltiges Virus, das von seiner
Morphologie her ähnlich ist wie die anderen Mitglieder der
Gattung Herpesviridae. Zwei antigenisch unterschiedliche HSVTypen werden als Typ 1 und Typ 2 bezeichnet.
Mit dem IDEIA HSV-Testkit werden alle nötigen Reagenzien
zum HSV-Nachweis in klinischen Proben mitgeliefert. Der Test
kann in weniger als zwei Stunden unter Einsatz der üblichen
Enzymimmunoassay-Instrumente und -Verfahren durchgeführt
werden und weist im Vergleich zu den Referenzmethoden
mit Zellkulturen eine ausgezeichnete Sensitivität (93,6%) und
Spezifität (97,8%) auf.
Die Virusisolation in Einschicht-Zellkulturen ist arbeits- und
zeitaufwändig, teuer und erfordert ein gewisses Maß an
technischer Erfahrung, das in vielen Laboratorien möglicherweise
nicht vorhanden ist.
Der IDEIA HSV-Test ist ein alternativer Diagnosetest zum direktem
Nachweis von Herpesvirus-Antigen in klinischen Proben. Bei
diesem Testverfahren werden monoklonale Antikörper zum
Nachweis von HSV 1- und HSV 2-Antigen und ein EnzymAmplifikationssystem zur Verstärkung des Testsignals eingesetzt3.
Die Durchführung des Enzymimmunoassays ist einfach und
schneller als die Virusisolation zum Nachweis von HSV in
klinischen Proben und Zellkulturen.
Gebrauchsanweisung beachten
5.2.1
Inhalt ausreichend für “N” Ansätze
Öffnen Sie die Plattenhülle, indem Sie sie entlang der
Schweißnaht aufschneiden. Brechen Sie die nötige Anzahl von
Mikrotiterstreifen ab und geben Sie sie in den Halterahmen.
Legen Sie die unbenutzten Mikrowells mit einem Trockenmittel in
die wiederverschließbare Plastikhülle zurück, verschließen Sie sie
vorsichtig und bewahren Sie sie bei 2-8°C auf. Mikrowells können
bis zu 6 Wochen nach der erstmaligen Öffnung der Packung
benutzt werden, wenn sie auf diese Weise gelagert werden.
Danksagung
Die Herstellung der in diesen Tests verwendeten monoklonalen
Antikörper erfolgte im Department of Pathology, University of
Cambridge, Cambridge, Großbritannien4.
4.
DEFINITIONEN
Die nachfolgenden Symbole wurden
Produktbeschreibung angewandt:
Die HSV-Typen 1 und 2 sind häufig an oberflächlichen Infektionen
der Mundhöhle, Haut, Augen und Genitalien beteiligt1,2. Darüber
hinaus werden, wenn auch seltener, Infektionen des zentralen
Nervensystems (Meningoenzephalitis) und schwere generalisierte
Infektionen bei Neugeborenen und immungeschwächten
Patienten beobachtet. Nachdem die Primärinfektion abgeklungen
ist, kann das Virus in latenter Form im Nervengewebe
weiterexistieren und von dort unter bestimmten Bedingungen
erneut aktiv werden und ein Wiederaufflackern der Symptome
verursachen.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es zwei HauptDiagnosemethoden zum Nachweis von HSV in klinischen Proben.
Zum einen durch Isolation von lebensfähigen Viren in Zellkulturen
mit anschließender Identifikation des Krankheitserregers durch
immunologische Mittel oder Elektronenmikroskopie;1,2 zum
anderen durch direkten Virus-Antigen-Nachweis in klinischen
Proben mit Hilfe von Fluorescein-markiertem monoklonalem
Antikörper oder Enzymimmunoassay.
Code- und Bestellnummer des Produkts
100mL Transportmedium: nichtionisches
Detergenz in einer Pufferlösung, die
Farbstoff, antimikrobielle Substanz und AntiSchaummittel enthält.
3mL Positivkontrolle: inaktiviertes Homogenat
aus HSV-infizierten HeLa-Zellen in proteinund detergenzhaltiger Pufferlösung.
12mL Negativkontrolle: Pufferlösung, die
antimikrobielle Substanz, Farbstoff und AntiSchaummittel enthält.
7mL Konjugat: mit alkalischer Phosphatase
konjugierter, muriner monoklonaler
Antikörper (Fab-Prime-Fragment) in
Stabilisierungspuffer, der Farbstoff und
antimikrobielle Substanz enthält.
125mL Waschpufferkonzentrat (x10):
Lösung, die Tris-gepuffertes Detergenz und
antimikrobielle Substanz enthält.
13mL Verstärker A: anorganische Salze und
gepufferte Enzymlösung, die TetrazoliumViolett und antimikrobielle Substanz enthält.
13mL Verstärker B: stabilisierte NADPH-Lösung
13mL Stopp-Lösung: 1 mol/L Phosphorsäure.
5.2. VORBEREITUNG, LAGERUNG UND WIEDERVERWENDUNG
DER TESTKIT- KOMPONENTEN
Mit dem IDEIA HSV-Testkitformat lassen sich bis zu 12
Probenchargen testen. Um eine optimale Leistungsfähigkeit
des Testkits sicherzustellen, sollten für die Lagerung aller
unverwendeten Testkit- Komponenten folgende Hinweise
beachtet werden.
3.
TESTPRINZIP
Bei dem IDEIA HSV-Test gelangen HSV-spezifische, murine
monoklonale Antikörper und ein Enzym-Amplifikationssystem
zum Einsatz3. Das in der klinischen Probe vorhandene HSV-Antigen
(das Typ1 und Typ 2 gemeinsam ist) wird von dem murinen
monoklonalen Antikörper gebunden, der an der Oberfläche von
Plastik-Kavitäten angelagert ist. Der Enzym-konjugierte murine
monoklonale Antikörper bindet an das “gefangene” Antigen;
anschließend katalysiert das Enzym die Umwandlung des
Substrats in das Produkt. Das so entstandene Produkt ist an einer
zweiten Enzymreaktion beteiligt, die eine Farbveränderung zur
Folge hat. Der Farbentwicklungsprozess wird durch Säurezugabe
unterbrochen. Eine signifikant höhere Farbintensität als die
Hintergrundfärbung deutet auf das Vorliegen von HSV-Antigen in
klinischen Proben hin (siehe Abschnitt 9).
N
überall
in
der
Hersteller
In-Vitro-Diagnostikum
Verwendbar bis
Chargenbezeichnung
Zulässiger Temperaturbereich für die Aufbewahrung
5.
GELIEFERTE REAGENZIEN
5.2.2
Mit
monoklonalem
Mikrotiterplatten -
Antikörper
beschichtete
Transportmedium -
Gebrauchsfertig geliefert. Es ist wichtig, das Transportmedium
vor Benutzung zu mischen.
Bestimmungen. - Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem Etikett
des Umkartons vermerkt.
Ein Anti-Schaummittel im Transportmedium lässt es trübe
erscheinen. Die Wirksamkeit des Tests wird dadurch jedoch
nicht beeinträchtigt, und die Trübheit ist nicht auf mikrobielle
Kontamination zurückzuführen.
5.1.
5.2.3
96 – Jeder Testkit enthält ausreichend Material für 96
INHALT DES IDEIA HSV-TESTKITS
Eine Gebrauchsanweisung
Eine verpackte Mikrotiterplatte mit 96
Kavitäten (mit 12 abbrechbaren Streifen à
8 Einzelkavitäten) beschichtet mit murinem
monoklonalem Anti-HSV-Antikörper. Eine
wiederverschließbare Plastikhülle wird
für die Aufbewahrung von unbenutzten
Mikrotiterstreifen mitgeliefert.
Jeweils eine Flasche der folgenden Reagenzien:
Positivkontrolle -
Gebrauchsfertig. Unverwendete Positivkontrolle bei 2-8°C
aufbewahren.
5.2.4
Negativkontrolle -
Gebrauchsfertig. Unverwendete Negativkontrolle bei 2-8°C
aufbewahren.
5.2.5
Konjugat -
Gebrauchsfertig.
aufbewahren.
5.2.6
Unverwendetes
Waschpufferkonzentrat -
Konjugat
bei
2-8°C
Geliefert als 10fach-Konzentrat. Waschpufferlösung in geeigneter
Stärke durch Mischen von einem Teil Waschpufferkonzentrat
und 9 Teilen frischem entionisiertem oder destilliertem Wasser
herstellen. Das gelieferte Konzentrat ist ausreichend für die
Zubereitung von bis zu 100mL Waschpufferlösung geeigneter
Stärke für jeden Streifen mit 8 Kavitäten. Waschpufferlösung in
geeigneter Stärke am Tag der Verwendung frisch vorbereiten
(siehe Abschnitt 8.2.10). Übriges Konzentrat bei 2-8°C lagern.
Unverwendete Waschpufferlösung in geeigneter Stärke nicht für
spätere Benutzung aufbewahren (siehe Abschnitt 8.2.10).
5.2.7
Verstärker A -
Gebrauchsfertig. Unverwendeten Verstärker A bei 2-8°C
aufbewahren.
5.2.8
Verstärker B -
Gebrauchsfertig. Unverwendeten Verstärker B bei 2-8°C
aufbewahren.
5.2.9
Stopp-Lösung -
Gebrauchsfertig.
aufbewahren.
Unverwendete
Stopp-Lösung
bei
2-8°C
6.
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN
6.1. REAGENZIEN
Frisches entionisiertes oder destilliertes Wasser zur Vorbereitung
der Waschpufferlösung.
6.2. ZUBEHÖR
Die folgenden Produkte sind für den Einsatz in Verbindung mit
dem IDEIA HSV-Testkit bestimmt. Nähere Information dazu
erhalten Sie von Ihrer zuständigen Oxoid-Niederlassung oder von
Ihrem Händler.
IDEIA HSV Extraction Buffer 10mL (Code-Nr. S601230-2).
IDEIA HSV Blocking Reagents (Code-Nr. S603330-2).
IDEIA PCE Chlamydia/HSV Wash Buffer Concentrate (X10) 125mL
(Code-Nr. S603930-2).
IDEIA HSV Transport Medium 100mL (Code-Nr. S605530-2).
7.
GERÄTE
Folgende Geräte sind erforderlich:
Saubere Schraubdeckelröhrchen
Vortex-Mixer
Sauberes, saugfähiges Papier (auf dem die Mikrotiterstreifen
trocken geklopft werden können)
Präzisionspipetten und Einmal-Pipettenspitzen für 50µL 1000µL
oder Messpastetten zur Abgabe von 200µL Probenmaterial
(fakultativ)
Abfallbehälter mit entsprechendem frischem Desinfektionsmittel
37°C-Inkubator
Automatischer Plattenreiniger (fakultativ) oder geeignetes Gerät
zum Waschen der Mikrotiterstreifen mit den 8 Kavitäten (siehe
Abschnitt 10.4.4). Achtung: Wenn mit einem automatischen
Plattenreiniger mit einem Waschkopf für 8 Kavitäten weniger als
8 Vertiefungen eines Streifens gewaschen werden sollen, ist es
wichtig, den Streifen vollkommen mit freien Mikrowells zu füllen.
Spektrofotometer oder EIA-Platten-Lesegerät, das in der Lage ist,
eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten, bestehend aus Streifen
mit jeweils 8 Kavitäten, mit einer Absorption von 490 nm und
einem Referenzwert von 620-650nm zu lesen. (Fakultativ, siehe
Abschnitt 10.5, Ablesen der Testergebnisse).
8.
VORSICHTSMASSNAHMEN
- In-vitro-Diagnostikum. Personen, die einen Test mit
diesem Produkt durchführen, müssen in die Durchführung
eingewiesen sein und über entsprechende Laborerfahrung
verfügen.
8.1. SICHERHEITSMASSNAHMEN
8.1.1
Die
Reagenzien
Transportmedium,
Konjugat,
Waschpufferkonzentrat,
Positivkontrolle,
Negativkontrolle und Verstärker A enthalten 15mmol/L
Natriumazid. Natriumazid ist ein Gift, das mit Bleiund Kupferleitungen reagieren und zur Bildung von
hochexplosiven Metallaziden führen kann. Nach der
Entsorgung der azidhaltigen Materialien immer mit
reichlich Wasser nachspülen.
8.1.2
Die Stopp-Lösung enthält 1mol/L Phosphorsäure.
Zur Vermeidung von Augen- und Hautkontakt
Schutzkleidung und Augenschutz tragen.
8.1.3
Die Positivkontrolle enthält inaktiviertes HSV-Antigen,
das nachweislich nicht infektiös ist. Trotzdem sollte
die Kontrolle als potenziell infektiös gehandhabt und
entsorgt werden. Die Positivkontrolle enthält außerdem
ein Detergenz (1 Vol%). Hautkontakt vermeiden.
8.1.4
Essen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten
von Speisen sowie Schminken sind im bezeichneten
Arbeitsbereich (Labor) verboten.
8.1.5
Reagenzien dürfen nicht mit dem Mund pipettiert
werden.
8.1.6
Beim Arbeiten mit klinischen Proben immer
Einmalhandschuhe tragen und nach dem Umgang
mit potenziell infektiösen Stoffen immer die Hände
waschen.
8.1.7
Alle klinischen Proben und Reagenzien entsprechend
den örtlich geltenden Vorschriften entsorgen.
8.1.8
Das Sicherheitsdatenblatt kann auf Anfrage
professionellen Benutzern zur Verfügung gestellt
werden.
8.2. TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN
8.2.1
Die Testkit-Komponenten dürfen nach Ablauf des
auf den Etiketten vermerkten Verfallsdatums nicht
mehr verwendet werden. Keine Reagenzien von
verschiedenen Chargen mischen oder austauschen.
8.2.2
Die
Reagenzien
werden
in
festgelegten
Arbeitskonzentrationen geliefert. Der Testerfolg kann
beeinträchtigt werden, wenn die Reagenzien verändert
oder unter anderen Bedingungen als den in Abschnitt
5.2 genannten aufbewahrt werden.
8.2.3
Kontamination der Reagenzien vermeiden.
8.2.4
Bei Einsatz der Tropfflaschenmethode sicherstellen,
dass alle Kontrollen und Reagenzien auf dieselbe Art
und Weise zugegeben werden. (Die Leistungsfähigkeit
des Kits kann beeinträchtigt werden, wenn eine
Kombination aus Pipetten- und Tropfflaschenmethode
angewandt wird).
8.2.5
Mehrfachproben von Verstärkerreagenzien vermeiden.
Jeweils die erforderliche Menge in ein sauberes
geeignetes Gefäß geben. Überschüssiges Reagenz nicht
zurück in die Tropfflasche geben.
8.2.6
Für jede Probe, jede Kontrolle oder jedes Reagenz
stets neue Einmal-Pipetten oder -Pipettenspitzen
verwenden (falls keine Tropfflaschen benutzt werden),
um Kreuzkontamination mit anderen Proben, Kontrollen
oder Reagenzien zu vermeiden, da dies zu fehlerhaften
Ergebnissen führen könnte.
8.2.7
Entionisiertes oder destilliertes Wasser zur Verdünnung
von konzentrierten Reagenzien in sauberen Behältern
aufbewahren, um mikrobielle Kontamination zu
vermeiden.
8.2.8
Sicherstellen, dass es zu keinem Zeitpunkt während
des Tests zu einer Kreuzkontamination zwischen den
verschiedenen Kavitäten der Mikrotiterstreifen kommt.
Das Konjugat darf andere Reagenzien oder Geräte
keinesfalls kontaminieren. Bei Nichtverwendung der
Tropfflaschenmethode sollte eine separate Pipette für
die Zugabe von Konjugat und eine separate Pipette für
die Zugabe von Verstärkungsreagenzien vorgesehen
werden. Den Rand der Kavitäten nicht berühren und
vermeiden, dass Konjugat darauf gespritzt wird. Am Rand
angetrocknetes Konjugat kann die Leistungsfähigkeit
des Tests beeinträchtigen.
8.2.9
Mikrowells dürfen nicht wieder verwendet werden.
8.2.10 Unverwendete Waschpufferlösung in geeigneter
Stärke nicht für spätere Benutzung aufbewahren.
Wenn Waschpufferbehälter nicht in Gebrauch sind, mit
entionisiertem oder destilliertem Wasser ausspülen und
trocknen lassen.
8.2.11 Das
Enzym-Amplifikationssystem
stellt
einen
hoch sensitiven Detektor von Molekülen der
alkalischen Phosphatase dar. Es ist sehr wichtig, dass
nichtgebundenes Konjugat durch sorgfältiges Waschen
der Mikrowells vor Zugabe der Verstärkerreagenzien
entfernt wird. Zum sorgfältigen Waschen der Kavitäten
der Mikrotiterstreifen nach den in Abschnitt 10.4.4
genannten Methoden vorgehen. Ineffizientes Waschen
kann ungenaue Ergebnisse zur Folge haben.
8.2.12 Die Geräte und das Zubehör für manuelles oder
automatisches Waschen dürfen nicht mikrobiell
kontaminiert sein, müssen richtig kalibriert sein und
gemäß den Herstellerangaben instandgehalten werden.
8.2.13 Bei diesem Test dürfen keine phosphatgepufferte
Kochsalzlösung (PBS) und andere phosphathaltige
Waschlösungen eingesetzt werden, um eine Hemmung
des Konjugatenzyms zu vermeiden, welche die
Leistungsfähigkeit des Tests beeinträchtigen könnte.
8.2.14 Waschgeräte, die zuvor mit Waschlösungen auf
Phosphatbasis benutzt wurden, müssen sorgfältig
mit entionisiertem oder destilliertem Wasser gespült
werden, bevor das Priming mit IDEIA PCE Chlamydia/
HSV-Waschpuffer (Code-Nr. S603930-2) in geeigneter
Stärke erfolgt.
9.
GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER PROBEN
Auf folgende Art gewonnene Proben können mit dem IDEIA HSVTestkit getestet werden:
Mit dem IDEIA HSV-Transportmedium gewonnene Proben
(siehe Abschnitt 9.3.1)
Mit dem Transportmedium für Virusisolation in EinschichtZellkulturen gewonnene Proben (siehe Abschnitt 9.3.2).
9.1. TRANSPORTMEDIUM
Soll das IDEIA HSV-Transportmedium für die Probengewinnung
eingesetzt werden, geben Sie jeweils 1mL Probentransportmedium
in saubere Schraubdeckelröhrchen. Die 1mL Einzelröhrchen
können bei 2-8°C 12 Monate lang oder bis zum Ablauf des auf
dem Röhrchenetikett vermerkten Verfallsdatum aufbewahrt
werden. Bei Raumtemperatur (15-30°C) 6 Monate lang lagern.
Achtung: Es ist wichtig, das Transportmedium vor Abgabe
oder Verwendung zu vortexen oder sorgfältig zu mischen. Das
Transportmedium enthält ein Anti-Schaummittel, das dem
Medium ein trübes Aussehen verleiht. Die Wirksamkeit des
Tests wird dadurch jedoch nicht beeinträchtigt, und die Trübheit
ist nicht auf mikrobielle Kontamination zurückzuführen. Das
Transportmedium enthält darüber hinaus ein starkes Detergenz,
das die Probe für Zellkulturen unbrauchbar macht.
9.2. PROBENGEWINNUNG
Eine gute Probengewinnungstechnik spielt für den optimalen
Nachweis von HSV in klinischen Proben eine entscheidende
Rolle. Proben aus klinischen Läsionen sollten von qualifiziertem
Fachpersonal mit Hilfe eines sterilen Tupfers gewonnen werden.
Proben müssen so gesammelt werden, dass sie so viel infiziertes
Material wie möglich enthalten. Dazu werden sterile Tupfer mit
einer Watte- oder Dacron®-Spitze und einem Stiel aus Plastik oder
gepresstem Papier empfohlen.
Cremes, Salben, Lotionen, Eis, Alkohol, Betadinlösung, Zink oder
ein vor kurzem genommenes Sitzbad können den Virusertrag
signifikant verringern8. Deshalb sollte die Anwendung dieser
Mittel nach Möglichkeit vor der Probengewinnung vermieden
oder bei der Probengewinnung dem Arzt mitgeteilt werden.
9.2.1
Klinische Proben
Geschwüre mit dem Tupfer kräftig abreiben, um infizierte Zellen
und Exsudat von der Basis des Geschwürs aufzunehmen.
Vesikel (Bläschen) müssen vorsichtig geöffnet, Flüssigkeit mit
dem Tupfer gesammelt und dann die Läsionsbasis mit dem Tupfer
abgetupft werden. Den Tupfer anschließend in ein sauberes
Schraubdeckelröhrchen mit entsprechendem Transportmedium
geben. Pusteln müssen wie Vesikel behandelt werden. Die Krusten
können zum Transportmedium in einem Schraubdeckelröhrchen
hinzugefügt oder trocken versandt werden. Proben bei 2-8°C
nicht länger als 3 Tage aufbewahren.
Wenn rektale oder anorektale Proben mit Stuhlmaterial
kontaminiert sind, kann dies zu falsch positiven Ergebnissen
führen. Diese Ergebnisse können durch Einsatz von IDEIA HSVBlockierungsreagenzien (Code-Nr. S603330-2) bestätigt werden.
9.2.2
Zervixproben von symptomatischen Patientinnen
Machen Sie mit dem Tupfer einen kräftigen Abstrich von sichtbaren
Läsionen (falls vorhanden) oder einen Zervikalabstrich. Den Tupfer
anschließend herausziehen, ohne dabei die Vaginaloberfläche zu
berühren, und in ein Schraubdeckelröhrchen mit entsprechendem
Transportmedium geben. Die Proben können bei 2-8°C nicht
länger als 3 Tage aufbewahrt werden.
9.3. PROBENVERARBEITUNG
9.3.1 Tupfer in IDEIA HSV-Transportmedium
Proben vor dem Test vortexen und anschließend wie in Abschnitt
10.2 beschrieben vorgehen.
9.3.2
Tupfer in Transportmedium zur Virusisolation
Zur Verarbeitung von Tupfern, die in Labortransportmedium
für die Virusisolation aufbewahrt werden, ist IDEIA HSV-
Extraktionspuffer (Code-Nr. S601230-2) erforderlich. Die Proben
dürfen erst nach Inokulation der Einschicht-Zellkulturen für
den IDEIA HSV-Test verwendet werden, da die Behandlung mit
konzentriertem Extraktionspuffer die Probe für die Virusisolierung
ungeeignet macht.
100µL Extraktionspuffer (Code-Nr. S601230-2) zu 900µL
Virustransportmedium hinzugeben. Anschließend die Probe wie
in Abschnitt 10.2 beschrieben verarbeiten.
Das im Kit mitgelieferte Transportmedium darf nicht für die
Verarbeitung von Tupfern in Virustransportmedium eingesetzt
werden, da dadurch keine optimale Extraktion des HSV-Antigens
aus dem Tupfer erfolgen kann.
10.
TESTDURCHFÜHRUNG
VOR
DURCHFÜHRUNG
DES
TESTVERFAHRENS
SIND
DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN TECHNISCHEN
VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN.
10.1. VORBEREITUNG DER KONTROLLEN
Negativkontrolle
Die Negativkontrolle mindestens 15 Sekunden lang im
Vortexschüttler mischen. Das Reagenz dann direkt in die
vorgesehenen Vertiefungen der Mikrotiterstreifen geben.
Positivkontrolle
Die Positivkontrolle 1 Minute lang im Vortexschüttler mischen.
Das Reagenz dann direkt in die vorgesehene Vertiefung geben.
Wenn nötig, kann eine zusätzliche Kontrolle mit einem geringeren
Reaktivitätsniveau getestet werden, um die Leistungsfähigkeit
des Testkits zu überprüfen.
10.2. BEHANDLUNG DER PROBEN UND KONTROLLEN
Alle verarbeiteten Proben (siehe Abschnitt 9.3) und Kontrollen
vor Zugabe in die Kavitäten der Mikrotiterstreifen 15 Sekunden
lang im Vortexschüttler mischen.
10.3. LAGERUNG DER BEHANDELTEN PROBEN
Die Proben können nach der Verarbeitung bei -20°C bis zu 4
Wochen aufbewahrt werden. Sollen Proben getestet werden,
die eingefroren waren, zunächst bei Raumtemperatur (15-30°C)
auftauen lassen und dann direkt vor dem Test mindestens eine
Minute kräftig vortexen.
10.4. ASSAYVERFAHREN
Es wird empfohlen, für die Zugabe der Reagenzien in die
Kavitäten während des ganzen Testverfahrens durchgehend
dieselbe Methode zu wählen: entweder Pipettenspitzen oder
Tropfflaschen oder automatische Sonde. Für kleine Testchargen
empfiehlt sich für die Reagenzien der Einsatz von Tropfflaschen,
da dadurch das wiederholte Eintauchen der Pipettenspitzen in
die Reagenzflaschen vermieden wird.
10.4.1 Zugabe von Proben und Kontrollen
Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen in den Halterahmen
geben. Anschließend jeweils 200µL Probenmaterial in die
entsprechenden Kavitäten geben. 6 Tropfen (oder 200µL)
Negativkontrolle und Positivkontrolle in gesonderte Vertiefungen
geben. (Für jede getestete Probencharge sollten mindestens drei
Kavitäten für die Negativkontrolle und eine separate Kavität für
die Positivkontrolle mitgeführt werden).
10.4.2 Konjugatzugabe
Nach Zugabe aller Proben und Kontrollen jeweils 1 Tropfen (oder
50µL) Konjugat in jede Kavität hinzugeben. Achten Sie darauf, die
Pipetten- oder Tropfflaschenspitze dabei nicht in die Mikrowells
einzutauchen, da dies zu Kreuzkontamination zwischen den
verschiedenen Kavitäten führen kann. Den Rand der Kavitäten
nicht berühren und vermeiden, dass Konjugat darauf gespritzt
wird. Vermeiden Sie außerdem, die Oberseite oder den Rand
der Kavitäten zu berühren oder mit Konjugat zu kontaminieren,
da dies die Leistungsfähigkeit des Tests beeinträchtigen kann.
10.4.3 Erste Inkubation
Einen Deckel über die Platten geben und 90 Minuten bei 35-37°C
in einer feuchten Kammer inkubieren.
10.4.4 Reinigen der Mikrowells
Die Mikrowells müssen mit frisch zubereiteter Waschpufferlösung
in geeigneter Stärke gereinigt werden (siehe Abschnitt 5.2.6).
Die Waschtechnik ist für den Testerfolg entscheidend (siehe
Abschnitt 8.2.10). Beim Waschen müssen alle Kavitäten (mit
mindestens 350µL Waschpuffer in geeigneter Stärke) vollständig
gefüllt und wieder entleert werden.
Vier Waschgänge sind unbedingt nötig (sowohl bei automatischer
als auch bei manueller Wäsche), die eine 2-minütige
Einweichphase während des zweiten Waschgangs oder aber eine
2-minütige Einweichphase während des Waschzyklus insgesamt
einschließen müssen.
Manuelles Reinigen
Wenn Sie die Mikrowells von Hand waschen, den Inhalt der
Kavitäten aufsaugen oder herausschütteln. Zur Reinigung frisch
zubereitete Waschpufferlösung verwenden und sicherstellen,
dass eine vollständige Füllung und Leerung der Kavitäten erfolgt.
Zwischen jedem Waschgang den gesamten verbleibenden
Waschpuffer entfernen, indem die Mikrotiterplatte umgedreht
und auf saugfähigem Papier ausgeklopft wird. Die Effizienz des
manuellen Waschens wird noch weiter gesteigert, wenn der
Waschpuffer aus einem Winkel zugegeben wird, der einen Wirbel
in den Kavitäten erzeugt. Nach dem letzten Waschdurchgang die
Platte umdrehen und auf saugfähigem Papier ausklopfen, um die
letzten Reste des Waschpuffers zu entfernen.
10.5. ABLESEN DER TESTERGEBNISSE
10.5.1 Visuelles Ablesen
Die Mikrowells können bis zu 30 Minuten nach der Zugabe von
Stopp-Lösung mit dem bloßen Auge beurteilt werden. Es wird
empfohlen, Mikrowells, bei denen die Farbintensität im Vergleich
zu der Negativkontrolle nur schwer zu interpretieren ist, auch
fotometrisch auszuwerten (siehe Abschnitt 10.5.2).
10.5.2 Fotometrisches Ablesen
Die Kavitäten müssen innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe
der Stopp-Lösung fotometrisch gelesen werden. Den Inhalt
der Kavitäten mischen und die Absorption jeder Kavität unter
Verwendung eines geeigneten Spektrofotometers oder eines
EIA-Platten-Lesegeräts bei 490nm ablesen. Vor dem Ablesen
sicherstellen, dass der Boden der Kavitäten sauber ist und dass
keine Fremdkörper in den Mikrowells vorhanden sind. Das
Plattenlesegerät muss vor dem Scannen der Platte gegen Luft
geblendet werden (d.h. ohne eine Platte im Halter).
Wahlweise sollte, wenn der Spektrofotometer oder das EIAPlatten-Lesegerät die Verwendung einer Referenz-Wellenlänge
zulässt (620–650nm), eine doppelte Wellenlängenmessung
erfolgen, die jegliche potenzielle Interferenz (verursacht durch
Anomalitäten wie Schmutz oder Spuren auf der optischen
Oberfläche der Kavitäten) ausschließt.
10.6. ZUSAMMENFASSUNG
VERFAHRENS
DES
IDEIA
HSV-ASSAY-
10.4.6 Zweite Inkubation
Einen Deckel über die Platten geben und 30 Minuten bei 35-37°C
in einer feuchten Kammer inkubieren.
10.4.7 Stoppen der Reaktion
2 Tropfen (oder 100µL) Stopp-Lösung in jede Kavität geben.
Darauf achten, dass der Inhalt der Mikrowells gut durchgemischt
wird. Das gefärbte Produkt ist 30 Minuten lang stabil. Nicht der
direkten Sonnenlichteinwirkung aussetzen, da das gefärbte
Produkt im Licht ausbleichen kann.
11.2. POSITIVKONTROLLE
Wie in Abschnitt 10.4.1 (Zugabe von Proben und Kontrollen)
beschrieben, muss jeder Assay eine Kavität mit Positivkontrolle
mit einschließen.
Visuelle Bestimmung
Die Kavität der Positivkontrolle sollte eine rote oder
magentafarbene Färbung aufweisen, die sich deutlich von den
Negativkontrollen unterscheidet. Ist dies nicht der Fall, sollten
die Ergebnisse nicht visuell sondern fotometrisch ausgewertet
werden, oder aber der Test sollte wiederholt werden.
Fotometrische Bestimmung
Der Absorptionswert der Positivkontrolle muss über 0,50
Absorptionseinheiten liegen. Ist dies nicht der Fall, sollte der Test
wiederholt werden.
Fotometrische Bestimmung
Klinische Proben mit Absorptionswerten, die über dem
Schwellenwert liegen, sind positiv (siehe Abschnitt 11.1).
Ergebnisse, die innerhalb eines Bereichs von 0,015
Absorptionseinheiten über oder unter dem Schwellenwert
liegen, sollten mit Vorsicht interpretiert und der Test besser
wiederholt oder neue Patientenproben verwendet werden.
Patientenergebnisse sollten nicht dokumentiert werden, wenn
die Kontrollwerte außerhalb der Sollwerte liegen.
10.4.5 Verstärkerzugabe
Bei der Zugabe von Verstärker A und B darauf achten, die
Mikrowells nicht mit den Pipetten- oder Tropfflaschenspitzen
zu berühren, da dies zu Kreuzkontamination zwischen den
verschiedenen Kavitäten führen kann.
Berechnung des Cut-off-Werts
Der Cut-off- oder Schwellenwert wird durch Addieren von 0,15
zum mittleren Negativkontroll-Absorptionswert bestimmt.
11.3. PROBEN
Visuelle Bestimmung
Jede Probe, die eine intensivere Rot-/Magentafärbung aufweist
als die Negativkontrollen, ist als positiv zu bewerten. Jede Probe
mit derselben oder einer blasseren Farbe als die Negativkontrollen
ist als negativ zu bewerten. Jede Probe, die eine zartrosa Färbung
aufweist, die der Farbe der Negativkontrollen ähnelt, sollte
fotometrisch bestimmt oder noch einmal getestet werden.
Wahlweise können auch noch einmal neue Proben vom Patienten
genommen werden.
Automatisches Reinigen
Automatische Plattenreiniger müssen so programmiert werden,
dass vier vollständige Waschgänge durchlaufen werden,
die eine 2-minütige Einweichphase während des gesamten
Waschgangs mit einschließen. Die Plattenreiniger müssen richtig
kalibriert sein, damit ein vollständiges Füllen und Entleeren der
Kavitäten zwischen den einzelnen Waschgängen garantiert ist.
Nach dem letzten Waschdurchgang die Platte umdrehen und
auf saugfähigem Papier ausklopfen, um die letzten Reste des
Waschpuffers zu entfernen.
In jede Kavität 2 Tropfen (oder 100µL) Verstärker A zugeben.
In jede Kavität 2 Tropfen (oder 100µL) Verstärker B zugeben.
liegen. Außerdem müssen sie innerhalb einer Bandbreite
von ± 0,05 Absorptionseinheiten vom Mittelwert der drei
Negativkontrollwerte liegen. Liegt ein Absorptionswert der
Negativkontrolle außerhalb dieses Bereichs, sollte dieser Wert
ausgeschlossen und der Mittelwert aus den zwei übrigen
Werten neu errechnet werden. Sind zwei NegativkontrollAbsorptionswerte nicht akzeptabel, so muss der Test wiederholt
werden.
11.
QUALITÄTSKONTROLLE UND INTERPRETATION DER
TESTERGEBNISSE
11.1. NEGATIVKONTROLLE
Wie in Abschnitt 10.4.1 (Zugabe von Proben und Kontrollen)
beschrieben, muss jeder Assay drei Kavitäten mit Negativkontrolle
mit einschließen.
Visuelle Bestimmung
Alle Kavitäten mit Negativkontrolle sollten farblos sein oder nur
eine leicht rosa Färbung aufweisen. Ist dies nicht der Fall, sollten
die Ergebnisse nicht visuell sondern fotometrisch ausgewertet
werden, oder aber der Test sollte wiederholt werden.
Fotometrische Bestimmung
Die einzelnen Absorptionswerte der Negativkontrollen
müssen bei weniger als oder gleich 0,30 Absorptionseinheiten
11.4. INTERPRETATION
UND
ÜBERPRÜFUNG
TESTERGEBNISSE
11.4.1 Interpretation der Testergebnisse
DER
Die folgende Tabelle stellt eine Zusammenfassung der
Interpretations- und Berichtsempfehlungen für die Testergebnisse
dar.
Tabelle 11.4
Zusammenfassung der Ergebnisinterpretation
und der Berichtsempfehlungen
Ergebnis
OD > CO + 0,015
OD = CO ± 0,015
OD < CO - 0,015
Interpretation
Positiv*
Berichtsempfehlungen
Vermutliches HSV-Antigen
(Kein Blocking-Test durchgeführt)
Nicht eindeutig* Ergebnis nicht eindeutig
bestimmbar. Test wiederholen.
Negativ
Kein HSV-Antigen nachgewiesen
OD = Optische Dichte (Absorptionseinheiten)
CO = Cut-off-Wert = Mittelwert der Negativkontrollen + 0,15
Absorptionseinheiten
* Positive und nicht eindeutige Ergebnisse sollten überprüft
werden.
11.4.2 Überprüfung der Testergebnisse
Wenn eine Überprüfung der im IDEIA HSV-Test als reaktiv
nachgewiesenen Proben für nötig erachtet wird, wird dazu
der Einsatz von IDEIA HSV-Blockierungsreagenzien (Code-Nr.
S603330-2) empfohlen. Der Blocking-Test zur Überprüfung der
Testergebnisse stellt eine zusätzliche Maßnahme im Rahmen der
Qualitätskontrolle für den Bereich Probengewinnung dar.
12.
GRENZEN DER METHODE
12.1. Die Probenqualität ist entscheidend für den Erfolg aller
diagnostischen Verfahren. Die gesammelten Proben
müssen so viel Virusantigen wie möglich enthalten (siehe
Abschnitt 9). Folglich schließt ein negatives Ergebnis die
Möglichkeit einer HSV-Infektion nicht aus.
12.2. Für
optimale
Testerfolge
muss
IDEIA
HSVTransportmedium oder Extraktionspuffer verwendet
werden. Die Leistungsmerkmale dieses Tests bei
Verwendung von anderen Zellkultur-Transportmedia sind
nicht validiert worden.
12.3. Die Leistungsmerkmale dieses Test bei Verwendung
von Proben von asymptomatischen Patienten, Liquor-,
Biopsiegewebe- oder Augenexsudatproben sowie bei der
Verwendung zur Bestätigung von Gewebekulturen sind
nicht validiert worden.
12.4. Mit diesem Test kann Herpes-simplex-Virus Typ 1 und
Typ 2 nachgewiesen werden, aber eine Differenzierung,
welcher der beiden Infektionstypen vorliegt, ist nicht
möglich.
12.5. Wenn die Möglichkeit eines Kaiserschnitts in Betracht
gezogen wird, sollte dieser Test nicht als einziges Mittel
zur HSV-Diagnose herangezogen werden. Vorherige
Zellkulturergebnisse (falls vorhanden) und Beurteilung
nach bestem klinischen Wissen sollten den Vorrang haben.
12.6. Es besteht die Möglichkeit, dass mit diesem Test auch
nicht-lebensfähige oder kulturnegative HSV oder HSVAntigene nachgewiesen werden.
12.7. Die Testergebnisse sollten in Verbindung mit den
verfügbarenen Informationen aus epidemiologischen
Studien, der klinischen Bewertung des Patienten und
anderen diagnostischen Verfahren interpretiert werden.
13.
SOLLWERTE
Die Positivitätsraten können je nach HSV-Prävalenz in
verschiedenen
Populationen
und
an
verschiedenen
geographischen Orten, nach Gewinnung, Handhabung, Lagerung
und Transport der Proben, Sexualverhalten und allgemeinem
Gesundheitsumfeld der untersuchten Population variieren.
Herpes simplex ist eine weltweit verbreitete menschliche
Infektionskrankheit. Über 80% der erwachsenen Bevölkerung in
den westlichen Ländern haben eine Primärinfektion erfahren,
die jedoch in vielen Fällen asymptomatisch verlaufen ist9. Im
Anschluss an die Erstinfektion kommt es bei etwa 45% der
Patienten mit oralen Infektionen und 60% der Patienten mit
Herpes genitalis immer wieder zu Infektionsrezidiven10.
Herpes-simplex-Virusinfektionen des Auges sind die Hauptursache
für Einweisungen in Augenkliniken10. HSV konnte aus dem
Genitaltrakt von 0,3 bis 5,4% der Männer und 1,0 bis 8,0% der
Frauen isoliert werden, die in Kliniken für Geschlechtskrankheiten
in Behandlung waren11, 12.
Bei symptomatischen primären und rezidivierenden Infektionen
können Läsionen auf der Haut, auf der Schleimhaut von Mund,
Rachen und Genitalien oder im Auge gefunden werden. Bei
Neugeborenen oder immungeschwächten Patienten kann sich
die Infektion jedoch auch weiter ausbreiten und auf andere
Organe wie Lunge, Hirn, Leber, Milz etc. übergreifen.
HSV-Antigen kann in den folgenden Flüssigkeiten vorliegen,
aus denen sich das Virus gewinnen lässt: Bläschenläsionen,
Speichel oder Ausscheidungen von anderen Infektionsorten wie
Augen, Rachen oder Genitalien. Darüber hinaus kann HSV bei
disseminiertem Herpes simplex aus infiziertem Gewebe kultiviert
werden, z.B. aus Gehirnbiopsieproben von Patienten mit einer
Herpes-simplex-bedingten Enzephalitis.
Die Wahrscheinlichkeit eines HSV-Nachweises nimmt mit
zunehmender Zeit nach Krankheitsausbruch und Entwicklung der
Läsionen ab. Die Wahrscheinlichkeit einer Virusisolation nimmt
mit Fortschreiten der Geschwür- und Krustenbildung und Heilung
ab. Die Proben sollten daher so früh wie möglich nach Auftreten
der Läsionen gewonnen werden5, 6. In einer Studie konnte das
Virus aus 94% der Bläschenläsionen, 87% der Pustelläsionen,
70% der Geschwüre und 27% der verkrusteten Läsionen isoliert
werden7.
14.
SPEZIFISCHE LEISTUNGSKRITERIEN
Alle hier aufgeführten Ergebnisse beruhen auf der Annahme, dass
die Sensitivität und Spezifität der Zellkultur-Methoden bei 100%
liegt.
14.1. KLINISCHE STUDIEN
Der IDEIA HSV-Test wurde in vier unabhängigen Labors, die
routinemäßige Diagnosen durchführen, gegen StandardZellkultursysteme getestet.
Insgesamt wurden 1375 klinische Humanproben mit dem
IDEIA HSV-Test getestet und die Ergebnisse mit jenen
des Zellkultursystems verglichen, das von den jeweiligen
Versuchslabors verwendet wurde (Tabelle 14.1). In diesen
Studien lag die Inzidenz der HSV-Infektion (in Zellkultur) bei 12,7
bis 36,9%.
Eine Probe wurde im IDEIA HSV-Test als positiv gewertet, wenn der
Absorptionswert der Probe bei 492 nm größer als der empfohlene
Cut-off-Wert war (siehe Abschnitt 11.1). Eine Probe wurde im
Zellkulturtest als positiv bewertet, wenn der charakteristische
zytopathische Effekt von HSV auftrat.
In zwei Testzentren wurden die positiven Zellkulturen mit Hilfe
von direkten Immunfluoreszenztests typisiert. Von den 37*
positiven Proben, die im Testzentrum 1 einem Typisierungstest
unterzogen wurden, waren 15/37 (40,5%) vom Typ 1 und 22/37
(59,5%) vom Typ 2. Im Testzentrum 4 waren 14/71 (19,7%) vom
Typ 1 und 57/71 (80,3%) vom Typ 2.
*(4 positive Proben standen für den Typisierungstest nicht zur
Verfügung.)
Die Ergebnisse des IDEIA HSV-Tests stimmten bei 1302 von 1375
Proben mit den Ergebnissen aus dem Zellkulturtest überein, was
einer Gesamtübereinstimmung von 94,7% entspricht.
Durch die Aufklärung von 29 abweichenden “falsch positiven”
IDEIA HSV-Testergebnissen unter Einbeziehung der verfügbaren
klinischen Detailinformationen ergab sich letztendlich eine
*
Gesamtübereinstimmung von 96,8% (1331/1375).
14.2. LEISTUNGSEIGENSCHAFTEN
Sensitivität*
Insgesamt lag die Sensitivität des IDEIA HSV-Tests bei 93,6%
(307/328).
Spezifität*
Insgesamt lag die Spezifität des IDEIA HSV-Tests bei 97,8%
(1024/1047).
Vorhersagewerte*
Insgesamt lagen die positiven und negativen Vorhersagewerte
des IDEIA HSV-Tests bei 93,0% (307/330) bzw. 98,0% (1024/1045).
Die Daten in diesen Spalten sind die neu berechneten
Werte nach Klärung von 29 “falsch positiven” IDEIA
HSV-Testergebnissen. Diese Proben stammten von
Patienten, die entweder positive Proben von benachbarten
Körperbereichen erbrachten, HSV-positive Partner hatten
oder bei denen bereits früher HSV-Infektionen aufgetreten
waren.
Tabelle 14.2:
Intra- und Inter-Assay-Reproduzierbarkeit der
IDEIA HSV-Testergebnisse
Intra-Assay (n=3)
Antigenwerte
*Nach der Klärung von 29 abweichenden “falsch positiven” IDEIA
HSV-Testergebnissen (siehe Tabelle 14.2).
14.3. TESTGENAUIGKEIT
In Tabelle 14.2 sind die Ergebnisse der Testgenauigkeitsstudien
zum IDEIA HSV-Test dargestellt.
Kontrollsuspensionen
von
3
verschiedenen
HSVAntigenkonzentrationen in IDEIA HSV-Transportmedium wurden
an drei verschiedenen Tagen jeweils dreimal getestet (also 9
Tests insgesamt). Die Ergebnisse sind in Absorptionseinheiten bei
492nm angegeben. Der beobachtete Bereich des Intra-Assay- und
Inter-Assay-Varianzkoeffizienten (CV) lag zwischen 1,2 und 6,6%
bzw. zwischen 5,0 und 8,4%.
14.4. KREUZREAKTIVIÄT
Die folgenden Organismen wurden mit dem IDEIA HSVTest getestet und zeigten keinerlei Kreuzreaktivität (bei
Konzentrationen von etwa 107 Organismen/ml in Kulturen, die
keinen Virus enthielten, und etwa 50-100% CPE in Virus-Kulturen).
Acholeplasma laidlawii
Acinetobacter Ssp
Aeromonas Ssp
Bacteroides Ssp
Campylobacter Ssp
Candida Ssp
Citrobacter Ssp
Chlamydia trachomatis
Clostridium Ssp
Zytomegalie-Virus
Enterobacter Ssp
Epstein-Barr-Virus
Escherichia coli
Gardnerella Ssp
Haemophilus influenzae
Klebsiella Ssp
Lactobacillus Ssp
Listeria Ssp
Mycoplasma Ssp
Neisseria gonorrhoeae
Peptococcus Ssp
Peptostreptococcus Ssp
Proteus Ssp
Pseudomonas Ssp
Salmonella Ssp
Serratia Ssp
Shigella Ssp
Staphylococcus aureus (Cowan-Stamm 1)
Staphylococcus Ssp (Koagulase-negativ)
Staphylococcus Ssp (Koagulase-positiv)
Streptococcus Ssp
Trichomonas Ssp
Ureaplasma urealyticum
Varicell-Zoster-Virus
Veillonella Ssp
Tabelle 14.1:
Vergleich der Testergebnisse aus IDEIA HSVTest und Zellkulturmethode
IDEIA HSV-TEST
STUDIE
% INZIDENZ
MIT
ZELLKULTUR
SENSITIVITÄT
VORHERSAGEWERTE
SPEZIFITÄT
*
POSITIV
*
NEGATIV
*
*
1. TAG
Inter-Assay (n=9)
2. TAG
3. TAG
Mittelwert
SD
% CV
Mittelwert
SD
% CV
Mittelwert
SD
% CV
Negativ
0,105
0,005
4,9
0,104
0,006
5,4
0,108
0,005
4,6
0,106
0,005
Leicht positiv
0,275
0,010
3,5
0,287
0,010
3,7
0,247
0,003
1,2
0,270
0,019
7,0
Stark positiv
1,279
0,079
6,2
1,205
0,080
6,6
1,100
0,037
3,4
1,195
0,100
8,4
15.
Mittelwert
SD
% CV
5,0
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94,9%
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95,5%
97,5%
(106/111) (659/676)
99,4%
(659/663)
84,5%
(93/110)
96,4%
(106/110)
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(68/71)
96,4%
(81/84)
92,5%
(148/160)
73,1%
(68/93)
87,0%
(81/93)
98,0%
(148/151)
98,0%
(148/151)
1 (UK)
35,3%
(41/116)
90,2%
(37/41)
90,2%
(37/41)
98,7%
(74/75)
98,7%
(74/75)
97,3%
(37/38)
97,3%
(37/38)
94,9%
(74/78)
94,9%
(74/78)
2 (UK)
36,9%
(89/241)
89,9%
(80/89)
90,2%
(83/92)
94,1%
(143/152)
96,0%
(143/149)
89,9%
(80/89)
93,3%
(83/89)
94,1%
(143/152)
94,1%
(143/152)
Insgesamt
85,5%
(148/173)
93,0%
93,6%
95,2%
97,8%
(278/299) (307/328) (1024/1076) (1024/1047)
84,2%
93,0%
(278/330) (307/330)
98,0%
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